1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
本课题的意义和应用前景：在本实验室前期的工作中，分离到一株能够完整矿化西维因的降解菌——rhizobiumradiobacter x9。其具有典完整的西维因降解途径，其中龙胆酸双加氧酶催化其西维因下游代谢途径的起始反应。通过基因组比对和分析，初步推测到一个龙胆酸双加氧酶的编码基因orf04697。本研究将通过对该基因的异源表达、蛋白纯化等方式，得到龙胆酸双加氧酶的纯酶，并研究其酶学特性和酶动力学参数，为西维因下游代谢途径的研究奠定基础。
国内外的研究情况：
西维因（1-萘基-n-甲基氨基甲酸酯），作为一种典型的氨基甲酸酯杀虫剂，因其具有广谱性、高效性的特点，而被广泛应用于林业、农业的害虫防治[1]。西维因的杀虫原理为：抑制乙酰胆碱酯酶的活性，导致神经递质乙酰胆碱大量积累，昆虫在不断的神经刺激下出现兴奋、痉挛的情况，最后瘫痪死亡[2][3]。然而，随着西维因的使用日益广泛，其弊端也日渐凸显。西维因的滥用导致其在土壤、水体中大量残留，对非靶向生物有不同程度的毒害作用，破坏生物多样性，影响食品安全，乃至人类健康。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：本研究将通过对龙胆酸双加氧酶的编码基因的异源表达、蛋白纯化等方式，得到龙胆酸双加氧酶的纯酶，并研究其酶学特性和酶动力学参数，为西维因下游代谢途径的研究奠定基础。
拟解决的关键问题：
1.利用大肠杆菌表达载体pet29a构建基因orf04697的诱导表达质粒，并导入大肠杆菌bl21中。
3. 研究的方法与方案
研究方法和路线
1将推测的龙胆酸双加氧酶的编码基因orf04697设计引物进行pcr扩增。
2克隆片段通过同源重组与载体pet29a连接构成重组载体。
4. 研究创新点
本项目原创性强，在西维因降解的途径中，龙胆酸双加氧酶是催化其西维因下游代谢途径的起始反应的关键酶，研究龙胆酸双加氧酶的酶学特性和酶动力学参数，通过调整环境条件，提高龙胆酸双加氧酶的活性，提高降解农药的效率。同时，通过底物特定结构的改变，可以探究龙胆酸双加氧酶对于其他相似农药的降解，为农药降解提供新思路。
5. 研究计划与进展
研究计划：
第一阶段：克隆到龙胆酸双加氧酶编码基因（初步推测为orf04697），验证其功能。完成重组载体的构建和筛选并诱导表达，进行纯化得到纯酶。
第二阶段：利用纯酶进行实验研究，研究纯酶的最适温度、最适ph、km值、金属离子对酶催化活性的影响等。设置不同梯度的实验条件，如不同的温度, ph值，特定金属离子对酶活性的影响并在最佳酶活条件下，计算其酶动力学参数（km，kcat等）。
