1. 研究目的与意义
目的：克隆和表达出荧光假单胞菌脂肪酶。
意义：随着全球经济的高速发展，能耗加速，环境污染问题严峻，传统能源枯竭，生物柴油作为一种新型的可再生替代能源，具诸多优点。目前生产生物柴油主要由化学法生产，但化学法合成生物柴油具以下缺点：工艺复杂，能耗高，醇回收困难，产物色泽深，后处理工序复杂并有碱液排放等。为解决上述问题，人们研究用生物酶法合成生物柴油，即用动植物油脂和低碳醇通过脂肪酶进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯或乙酯。酶法生产生物柴油具有条件温和，酶用量小，转化率高，无污染排放等优点，但酶制剂成本高，限制了工业化生产。因此，本研究意在高效表达脂肪酶基因，提高脂肪酶的转酯能力，为酶法生产生物柴油新工艺产业化做一些探索。
2. 国内外研究现状分析
脂肪酶的研究已有上百年的历史，但脂肪酶用于催化合成生物柴油却是近几年才开始的全新研究领域，多种荧光假单胞菌脂肪酶基因（如HU380、LipB52等）已被克隆并研究，尚在研究之中。由于酶法生产生物柴油具有条件温和，酶用量小，转化率高，无污染排放等优点，符合绿色化学发展方向，但酶制剂成本高，酶易失活，使用寿命短，限制了工业化生产。相信通过非水酶学与化学、生物化学、微生物学等学科的结合，生物酶法生产生物柴油的上述问题有望得到解决。
3. 研究的基本内容与计划
研究内容：
本研究拟在初步查明荧光假单胞菌脂肪酶基因序列的基础上，克隆出荧光假单胞菌脂肪酶基因，将其在毕赤酵母中进行表达。基于荧光假单胞菌脂肪酶具有高活力，反应速度快，无位置特异性等特点，可大幅提高酶法催化的效率，可为酶法生产生物柴油新工艺产业化提供有力的技术支持。
本论文的实验计划为：
4. 研究创新点
本研究在初步查明荧光假单胞菌脂肪酶基因序列的基础上，克隆出荧光假细胞菌脂肪酶基因，将其在毕赤酵母表达系统中表达，。选择毕赤酵母表达系统的优势：能正确引导蛋白质分泌到细胞外，同时毕赤酵母自身分泌的蛋白质少，便于外源蛋白的纯化。
由于荧光假单胞菌脂肪酶具有高活力，在多种水溶性有机溶剂的存在下得到激活并保持稳定，对一些水不溶性的有机溶剂也具有一定的耐受性，无位置特异性等特点，可大幅提高酶法催化的效率，可为酶法生产生物柴油新工艺产业化提供有力的技术支持。
