1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.课题意义
水稻(Oryza Sativa L.)是重要的粮食作物，世界上超过一半人口以其为主食[1]。随着生活水平和消费水平的提高，生产上对于优质水稻新品种的需求也逐渐增加。稻米品质主要分为外观品质、食味品质、营养品质、碾磨品质和加工品质等，每一类型的品质都有相对应的评价指标。其中，外观品质和食味品质是最重要的稻米品质性状和评价指标，而粒形、垩白、整精米率和直链淀粉含量是稻米品质的定级指标[2]。水稻稻米品质是多基因控制的复杂农艺性状，品质与其他农艺性状间通常难以协调统一，同时各品质性状间及品质与环境间又互相影响，极大地限制了稻米品质的遗传改良。因此破解控制稻米重要品质性状形成的调控机制，对稻米品质改良和品种选育具有十分重要的意义。
稻米胚乳内所含有的淀粉根据其结构、组成可以分为两类：直链淀粉(由α-1,4糖苷键连接的多聚D-葡萄糖)和支链淀粉(在以α-1,4糖苷键连接的主链上通过形成α-1,6糖苷键引入支链的多聚D-葡萄糖)。前者是以一种线性无序状态存在,而支链淀粉则是构成淀粉半晶体结构的主要成分。一般认为，直链淀粉含量(Amylose content, AC)是稻米食味品质的决定因素。
水稻蜡质基因(Waxy, Wx)编码结合在淀粉粒上的淀粉合成酶(Granuale bound starch synthase Ⅰ， GBSSⅠ)，催化合成胚乳中直链淀粉，是稻米直链淀粉含量的主要控制基因，也是胶稠度、糊化温度的影响基因，对稻米蒸煮食味品质起着决定性的作用。因此重点挖掘稻米蜡质(Waxy,Wx)基因的等位变异位点，可为稻米品质提供良好的改良策略。
2.国内外研究进展
2.1 Wx基因的结构及表达
水稻Wx基因位于第６染色体短臂，由14个外显子和13个内含子组成[3]。Wx基因在水稻发育种子胚乳中特异表达，它的转录起始位点位于第1外显子内，而翻译起始密码子位于第2外显子中。因此，在非糯水稻品种中首先转录出一个3.3 Kb的前体RNA，然后经剪切后形成一个2.3Kb的成熟mRNA，成熟mRNA进一步翻译出GBSSⅠ[4]，催化多聚D-葡萄糖通过α-1,4糖苷键连接，完成直链淀粉的延伸反应。
2.2 Wx基因的等位变异类型
Wx基因在稻属栽培种中具有非常丰富的变异类型。不同的等位基因在序列上有一定差异（表1），导致Wx基因表达差异，从而引起稻米直链淀粉含量与品质的不同。
表1 Wx等位基因变异类型
Table 1Different alleles of the Wx gene inrice
| 等位变异 | 第1内含子5’端碱基剪切处的第一个碱基 | 有义突变位点 | AC（%） | 参考文献 | ||
| 变异位点 | 突变类型 | |||||
| 外显子 | 碱基位点 | |||||
| Wxa | G | / | / | / | 25-30 | [5].[6] |
| Wxb | T | / | / | / | 15-18 | [5],[6] |
| Wxin | G | 6 | 62 | A-C | 18-22 | [7],[8] |
| Wxop | G | 4 | 77 | A-G | ≤10 | [7],[9] |
| Wxhp | G | 4 | 77 | A-G | ≤10 | [10] |
| Wxmq | T | 4 | 53 | G-A | ≤10 | [11],[12] |
| 5 | 52 | T-C | ||||
| Wxmp | T | 4 | 53 | G-A | ≤10 | [13] |
| wx | T/G | 1 | 108-131 | 23bp插入 | ＜2 | [5],[14],[15] |
Wxa主要存在于籼稻品种中，控制高直链淀粉含量的形成，稻米直链淀粉含量一般都在25%以上，最高的可达30%以上[5]。在含有Wxa等位基因的水稻品种中，胚乳转录出的3.3 Kb前体RNA被完全剪切，产生大量2.3 Kb的成熟mRNA，从而合成较多的GBSSⅠ酶，大量合成直链淀粉[6]。稻米中直链淀粉含量高，糊化温度也往往较高，胶稠度降低，从而使米饭的粘性、柔软性和光泽度变差，进而严重影响米饭的质地与食味。
Wxb主要存在于粳稻品种中，直链淀粉含量相比于含Wxa的水稻品种低了很多，一般在15-18%之间[5]。与Wxa基因序列比较，主要的差异是在Wxb基因第一内含子的5’端剪切处第一个碱基为T，而Wxa中则为G（表1）。这一个单核苷酸多态性(SNP)位点直接影响了第一内含子的剪切效率，即影响了由3.3 Kb前体RNA剪切形成2.3 Kb成熟mRNA的效率。在Wxb类品种的发育种子中，由Wxb基因转录的前体RNA在剪切为成熟mRNA时效率降低，只合成少量的成熟mRNA，从而导致GBSSⅠ量降低，最终使合成的直链淀粉显著减少[6]。这类稻米由于直链淀粉含量中等偏低，因此其米饭粘性、柔软性和光泽度明显优于Wxa类品种。
Wxin主要存在于东南亚热带地区的一些品种中，其成熟种子中一般具有中等直链淀粉含量18-22%[7]。与较早发现的Wxa和Wxb相比，Wxin第一内含子5’端剪切处碱基仍为G，突变点位于位于第6外显子第62位碱基（表1），由Ａ突变为Ｃ，导致编码的酪氨酸突变为丝氨酸。在这类突变中，Wxin基因转录产生的3.3 Kb前体RNA能正常剪切形成2.3 Kb成熟mRNA，但是成熟mRNA的量要少于Wxa品种，但要高于Wxb类品种，其GBSSⅠ蛋白量也介于两者之间[8]，因此最终的直链淀粉含量也介于两者之间，表现为中等水平。
Wxop等位基因主要存在于一些籼稻品种中，主要分布于印度、尼泊尔、印度尼西亚及中国南方等地[9]。通过序列比较分析发现Wxop第一内含子5’端剪切处碱基仍为G，突变位点位于第４外显子第77位碱基（表1），由Ａ突变为G，导致编码的天冬氨酸突变为甘氨酸。Wxop品种类的成熟种子表现为不透明、胚乳直链淀粉含量一般在10%左右或10%以下[7]。
Wxhp等位基因发现于中国云南品种毫屁（Haopi），直链淀粉含量为9.7%。通过序列检测，与Wxa和Wxb比较，Wxhp在启动子中的CT重复序列与高直链淀粉含量的籼稻品种相当，在其第1内含子5’端剪切点的碱基为Ｇ，与Wxa相同；但是，在第4外显子第77位碱基有一个A-G的SNP突变（表1），此位点的突变使得第４外显子编码的第165位天冬氨酸突变为甘氨酸[10]。
Wxmq主要存在于一些粳稻种子中，其直链淀粉含量约为10%或更低[11]。通过基因序列比对，发现Wxmq相比于Wxb基因，在第1内含子5’端剪切点的碱基仍为T，其编码区域有两个位置发生突变，分别为第４外显子第53位碱基G-A的SNP（表4），及第5外显子第52位碱基T-C的SNP（表1），分别导致了第４外显子编码的第158位氨基酸由精氨酸突变为组氨酸、第５外显子编码的第191位氨基酸由酪氨酸突变为组氨酸[12]。
Wxmp等位基因发现于低直链淀粉含量粳稻品种(Milky Princess)，该品种中Wxmp的表达水平要低于含有Wxb的日本晴，直链淀粉含量仅为8.3%。与Wxb基因相比，在第1内含子5’端剪切点的碱基仍为T，Wxmp仅在其第4外显子第53位碱基发生一个有义SNP突变，由G突变为A（表1），使得第４外显子编码的第158位精氨酸突变为组氨酸[13]。
wx基因存在于糯稻品种中，是Wx基因的隐性缺失突变，在水稻发育种子中不能正常表达[5]。糯稻品种中Wx不能表达的原因在于其第２外显子有一段23bp的插入（表1），导致基因表达出现移码突变。所以一般检测不到基因的转录产物和GBSSⅠ蛋白，最终无法合成直链淀粉[14]。糯稻品种种子中一般没有直链淀粉，或仅含有极微量的直链淀粉，所以成熟稻米外观表现为不透明的蜡质状，米饭黏软。
2.3 Wx基因的育种利用
栽培稻中直链淀粉含量的变异非常广泛，其中Wx基因存在复等位变异是引起这种变化的最主要原因。因此，可依据不同地区人们对稻米食味的喜好，在水稻品质育种中充分地利用这些等位变异。
籼稻品种一般携带Wxa基因，因此直链淀粉含量普遍偏高，稻米的食味品质也较差。育种家们通过分子标记辅助选择，将我国籼型杂交稻重要亲本龙特甫和珍汕97的Wxa基因替换成了Wxb，选育出了携带Wxb基因的杂交稻品种，显著降低了稻米的直链淀粉含量，改善了稻米的蒸煮食味品质[16]。
Wxin相比于Wxa可适当降低稻米的直链淀粉含量，有科研工作者将来源于Basmati370品种中的Wxin导入到缅甸籼稻品种Manawthukha中，也成功降低了其直链淀粉含量，改善了稻米品质，该稻米在市场上也更受消费者的欢迎[17]。
在我国，软米因为其软粘的口感，优良的食味品质而越来越受到消费者的喜爱，我国育种家利用来源于日本品种关东194的Wxmp基因，成功选育出高产优质的南粳系列稻米品种，满足了广大消费者的需求，产生了极大的经济效益[18],[19],[20]。
3.应用前景
目前，随着社会的进步和经济的发展，人们对粮食作物品质的要求越来越高。当前对于水稻育种的目标己从往年的单纯提高产量而转移至现在的更加注重稻米品质方面。在蒸煮与食味品质方面，胚乳中直链淀粉含量是较大的影响因素，直链淀粉含量低，则米质较软，口感较好。
水稻品种的直链淀粉含量变异丰富，直链淀粉结构也存在丰富的变异，对Wx基因等位变异的发掘与利用是解析稻米品质变异的重要途径，更是稻米品质改良的重要基础。
参考文献：
[1] Yearbook FAOS. World food andagriculture [J]. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome,2013: 2013.
[2] 刘贵富,陈明江,李明等. 水稻育种行业创新进展[J]. 植物遗传资源学报, 2018, 19(03): 416-429.
[3] Wang ZY, Wu ZL, Xing YY, etal. Nucleotide sequence of rice waxy gene [J]. Nucleic Acids Res, 1990, 18:58-98.
[4] Cai XL, Wang ZY, Xing YY, etal. Aberrant splicing of intron 1 leads to the heterogeneous 5’UTR anddecreased expression of waxy gene in rice cultivars of intermediate amylosecontent. Plant Journal, 1998, 14: 459-465.
[5] Sano Y. Differential regulationof waxy gene expression in rice endosperm [J]. Theor Appl Genet, 1984, 68:467-473.
[6] Wang ZY, Zheng FQ, Shen GZ, etal. The amylose content in rice endosperm is related to thepost-transcriptional regulation of the waxy gene. Plant Journal, 1995, 7(4):612-622.
[7] Mikami I, Uwatoko N, Ikeda Y,et al. Allelic diversification at the Wx locus in landraces of Asian rice[J].Theor Appl Genet, 2008, 116(7): 979-989.
[8] Dung LV, Mikami I, Amano E, etal. Study on the response of dull endosperm 2-2, du2-2, to two Wx alleles inrice [J]. Breeding Science, 2000, 50(3): 215-219.
[9] 曹瑞珍,张泽民,张桂权.利用微卫星标记鉴定水稻Wx座位上的复等位基因[C]．作物科学研究理论与实践——2000作物科学学术研讨会文集, 2001.
[10] Liu LL, Ma XD, Liu SJ, et al.Identification and characterization of a novel Waxy allele from a Yunnan ricelandrace [J]. Plant Molecular Biology, 2009, 71(6): 609-626.
[11] Suto M, Ando I, Numaguchi K,et al. Breeding of low amylose content paddy rice variety “Milky Queen” withgood eating quality [J]. Jpn.J.Breed, 1996, 46: 221.
[12] Sato H, Suzuki Y, Sakai M, etal. Molecular characterization of Wx-mq, a novel mutant gene for low-amylosecontent in endosperm of rice(Oryza sativa L.) [J]. Breeding Science, 2002,52(2): 131-135.
[13] Yang J, Wang J, Fan FJ, etal. Development of AS-PCR marker based on a key mutation confirmed byresequencing of Wx-mp in Milky Princess and its application in japonica, softrice(Oryza sativa L.) breeding [J]. Plant Breeding, 2013, 132(6): 595-603.
[14] Inukai T, Sako A, Hirano HY,et al. Analysis of intragenic recombination at Wx in rice: correlation betweenthe molecular and genetic maps within the locus [J]. Genome, 2000, 43(4):589-596.
[15] Wanchana S, Toojinda T, TragoonrungS, et al. Duplicated coding sequence in the Waxy allele of tropical glutinousrice (Oryza sativa, L.) [J]. Plant Science, 2003, 165(6): 1193-1199.
[16] Liu Q, Cai X, Li Q, et al.Molecular marker-assisted selection for improving cooking and eating quality inteqing and its hybrid rice [J]. Acta Agronomy Sinica, 2006, 32: 64-69.
[17] Myint Y, Khin TN, VanavichitA, et al. Marker assisted backcross breeding to improve cooking quality traitsin Myanmar rice cultivar Manawthukha [J]. Field Crops Research, 2009, 113(2):178-186.
[18] 王才林,张亚东,朱镇等. 通过分子标记辅助选择培育优良食味水稻新品种南粳46 [J]. 中国水稻科学, 2009, 23(1): 25-30.
[19] 王才林,张亚东,朱镇等. 优良食味粳稻新品种南粳5055的选育及利用[J]. 农业科技通讯，2012(2): 84-88.
[20] 王才林,张亚东,朱镇等. 优良食味粳稻新品种南粳9108的选育与利用[J]. 江苏农业科学, 2013, 41(9): 86-88.2. 研究的基本内容和问题
1.研究目标
水稻是世界上最主要的粮食作物之一。随着经济社会的发展，人们对稻米品质的要求越来越高。直链淀粉含量是影响稻米蒸煮与食味品质的重要因素，而水稻蜡质基因(waxy,wx)是控制直链淀粉合成的关键基因。本研究收集自世界各地的80份水稻种质资源为材料，对其wx基因全序列进行测序分析，并测定了供试材料稻米的主要理化品质，对wx基因遗传多样性与稻米主要理化品质间的关系进行分析。
3. 研究的方法与方案
1.研究方法
1.1 表型鉴定
5月于播种实验所需水稻品种材料，10月收获成熟种子。并于同年11月种植在南繁基地，4月收获成熟种子。种子成熟后，每个品种随机混收10株以上植株上的成熟种子，在灯箱下观察各品种材料的表型，包括垩白、胚乳颜色、种皮颜色、粒长、粒宽、透明度等，对收获种子进行去杂与实验材料挑选。
4. 研究创新点
目前尽管对调控稻米品质形成的分子机制进行了广泛而深入的研究，也确定了Wx 基因是调控稻米 AC 的主效基因，但是以往研究主要是针对已从栽培稻品种（系）发现的已知单倍型，而有关Wx 基因遗传多态性及其对稻米AC 影响的研究鲜有报道。本研究可通过来自世界各地的软米材料，系统研究Wx基因的功能、效应，明确Wx基因不同单倍型影响稻米理化特性的分子机理，可探索不同单倍型在其它基因背景下对稻米品质的效应，有助于更深入的了解植物淀粉合成调控的分子机制，同时也可为培育具有更优良的蒸煮食味品质、以及更有益人体健康的稻米新品种提供了新资源、新策略。
5. 研究计划与进展
1.研究计划
（1）2017年11月-2018年4月：于南京农业大学水稻所海南南繁基地种植实验材料，收集叶片提取水稻基因组总dna，并扩增wx基因；收获成熟种子后进行直链淀粉含量测定。
（2）2018年5月-2018年11月：在南京农业大学水稻所南京土桥基地种植实验材料，收集叶片提取水稻基因组总dna，并扩增wx基因；收获成熟种子后进行直链淀粉含量测定。并将前后两次结果进行对照。
