1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.1研究意义
随着我国人民消费水平逐步提高、城镇居民消费结构变化，羊肉渐渐受到消费者的欢迎。目前，国家对标准化规模养羊建设扶持力度不断加大，羊业生产转型加快，因此急需适应集约化舍饲的高繁羊种出现。湖羊是适合人口密集地区生态畜牧业发展的优良畜种，以湖羊为模式动物研究繁殖机理，对动物育种工作的实践应用具有重要的指导意义。本课题组前期研究提示，smad2蛋白通过协调tgf-β信号通路调节垂体生殖激素lh、fsh的合成，以影响湖羊的繁殖性能。smad2表达异常可能会导致细胞信号转导、细胞命运分化、靶基因转录、互作基因（如gdf9、fecb）表达等过程紊乱[1]，进而导致生殖激素分泌异常、胚胎性别决定异常、性腺功能紊乱甚至引发生殖疾病[2]。但是smad2对湖羊繁殖性能的调控是复杂的系统性过程，受诸多因素影响和调节，其在雄性湖羊生殖系统中的研究还少有涉及。smad2在不同时期湖羊睾丸是否表达、表达规律如何、以及对睾酮激素合成分泌的调节机制目前还未见报道。这些问题的深入研究可以为动物繁殖领域知识探索提供宝贵经验，为高繁绵羊的培育提供理论基础、对保护绵羊的生殖健康、促进绵羊高效繁殖具有重要意义。
1.2国内外研究进展
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
（1）分析smad蛋白家族在湖羊睾丸发育中的表达规律；
（2）揭示smad2蛋白及其家族在湖羊各组织中的表达规律；
3. 研究的方法与方案
| 研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 研究方法： 本试验主要用到湖羊睾丸间质细胞原代培养技术、免疫荧光组织/化学法、RNA提取、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）、RNA干扰技术、蛋白质印迹（Western blot）、ELISA酶联免疫吸附技术、生物信息学分析等。 技术路线： 见附件
实验方案： （1）SAMD蛋白家族在湖羊睾丸发育中的表达规律 选取4个时期（3M，7M，9M，2Y）体况相近的健康雄性湖羊，每组3只。屠宰之后迅速摘取睾丸组织，取睾丸组织两份，一份用预冷的PBS冲洗后放入4%的多聚甲醛溶液中固定，另一份放入冻存管中，液氮速冻后放入-80℃冰箱冷冻保存备用。 qRT-PCR：取出置于-80℃的不同日龄绵羊睾丸，采用Trizol法提取总RNA，并进行RNA质量检测，根据NCBI数据库资料设计SMAD2及其家族基因的引物，由南京擎科生物技术有限公司合成。以cDNA为模版根据SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒操作说明进行qRT-PCR反应揭示SMAD家族在睾丸发育中的表达变化。 （2）SMAD2蛋白及其家族在湖羊不同组织中的表达规律 采取9月龄湖羊不同组织（心、肝、脾、肾、十二指肠、胃、睾丸、肌肉），按照Trizol试剂盒（TaKaRa公司生产）说明书提取总RNA，测定浓度和纯度后，根据PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒（TaKaRa公司生产）反转录为cDNA。利用qRT-PCR技术分析SMAD2蛋白及其家族在湖羊不同组织中的表达水平。 （3）SMAD2蛋白在在湖羊睾丸发育中的表达模式 分别利用免疫组化进行SMAD2蛋白表达定位、qRT-PCR和Western blot进行SMAD2基因在不同发育阶段的表达变化分析。主要方案如下： 免疫组化：分别用石蜡包埋（1）中获得的不同日龄（3M、7M、9M、2Y）睾丸组织，包埋后按照6/切片的厚度切片，实验操作按照武汉博士徳SABC试剂盒操作说明进行。 qRT-PCR：取出（1）中置于-80℃的不同日龄（3M、7M、9M、2Y）睾丸组织，采用Trizol法提取总RNA，进行RNA质量检测后反转录为cDNA。根据（1）中设计并合成的引物，，进行qRT-PCR反应。qRT-PCR反应根据SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒操作说明进行。 Western blot：取出（1）中置于-80℃的不同日龄（3M、7M、9M、2Y）睾丸组织，按照碧云天蛋白裂解液操作说明书提取蛋白，BCA蛋白试剂盒定量。各组蛋白上样量为40～60 μg，利用SDS-PAGE电泳对其进行分离，分离电压设置为180V 25min，转膜电压设置为100 V 12min，用5%BSA封闭2 h。完成后孵育Rabbit anti-SMAD2，4℃孵育12～16h，ECL发光液显色，凝胶成像系统拍照分析，利用Image J软件对其灰度值进行分析。 （4）SMAD2蛋白对睾丸间质细胞的功能影响 选择健康的3-4月龄湖羊公羊，并进行去势，获取完整睾丸，置于添加有5%双抗的生理盐水中，在两小时内带回实验室。在超净台中进行睾丸白膜剥离、DPBS清洗等，剪去一小块组织，利用胶原酶、胰酶两步消化的方式，获取单细胞悬液，并进行40 um过滤，滤出液于1500 rpm离心5min，弃上清，用DPBS洗涤三次，加入10%血清的D/F12培养基重悬，调整细胞密度为2105个/mL，放入37℃、5%CO2培养箱中培养。培养1h后更换培养液除去未贴壁的生精细胞，之后每24小时观察一次并换液。待原代睾丸间质细胞接近90%汇合时，用胰蛋白酶消化，按照1 : 3传代，部分细胞继续培养，另一部分置于液氮冷冻备用。 RNA干扰：由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成SMAD2基因的siRNA，将稀释后的siRNA和脂质体混合均匀制成转染液，室温孵育15min，弃细胞培养液，用DPBS洗涤细胞3次，添加转染液和Opti-MEM，混匀后放入细胞培养箱中，6h后更换为常规培养液继续培养，24h后收集细胞和细胞上清液。 qRT-PCR：采用Trizol法提取细胞总RNA，进行RNA质量检测后反转录为cDNA。根据（1）中设计并合成的引物，以cDNA为模版，进行qRT-PCR反应。qRT-PCR反应根据SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒操作说明进行。 Western blot：按照碧云天蛋白裂解液操作说明书提取细胞蛋白，BCA蛋白试剂盒定量。各组蛋白上样量为40~60，SDS-PAGE对其进行分离，分离电压设置为180V 25min，转膜电压设置为100 V 12min，用5%BSA封闭2 h；孵育Rabbit anti-SMAD2，4℃孵育12～16h，ECL发光液显色，凝胶成像系统拍照分析，利用Image J软件对其灰度值进行分析。 ELISA：根据Kmaels Biotech Co.,Ltd.的ELISA试剂盒操作说明，利用收集的细胞上清液，分析睾酮激素水平。首先，将酶标孔板定为标准孔、样品孔和对照孔，将50不同浓度的标准液添加到标准孔中，并在样品孔中添加10细胞上清液样品和40样品稀释液。其次，将50辣根过氧化物酶标记的检测抗体添加到每个孔中，37℃孵育1h。用洗涤液将孔洗涤5次后，将50底物A和B加入每个孔中，并在室温避光条件下孵育15min，最后加入50终止液，一定时间内于450 nm波长处检测OD值。 可行性分析： （1）研究基础方面：本试验所依托的实验室多年从事绵羊育种及繁殖研究，在雄性生殖等研究领域已积累了比较丰富的经验，主持大量国家科研项目，相关研究围绕动物繁殖与育种、动物胚胎工程发表学术论文200余篇，培养了许多优秀的研究人才，具备完成本项目的坚实基础。 （2）人员设备方面：本试验所属的“动物遗传育种与繁殖学科”为校级重点学科，所在的江苏省家畜胚胎工程实验室为学校“211”工程重点投资建设的研究中心之一，现有NIKON显微操作仪及自动成像系统、凝胶成像仪、荧光显微镜、定量PCR仪、低温高速离心机等设备，仪器设备先进齐全，完全可以满足本课题的研究需要。本试验主要由张艳丽教授指导，熟悉绵羊生殖领域的理论基础，具备丰富的实践经验，能保证本试验顺利完成。 （3）技术和方法方面：本试验所依托的课题组在绵羊生殖细胞体外培养、基因表达检测、蛋白分析、转录组学、代谢组学、生物信息学等方面均进行了深入研究，研究方案建立在本人以及指导老师大量的文献查阅基础上，试验设计循序渐进、可操作性强，各项研究易于实施。 |
4. 研究创新点
（1）研究领域的创新：国内外对SMAD2蛋白及其家族的研究主要集中于人类和模式动物上，在畜牧生产动物相关研究还处于探索阶段。本试验的开展可明晰SMAD2蛋白及其家族在睾丸发育过程中的角色、揭示SMAD2对雄性湖羊睾酮激素分泌的影响，为后续的研究提供宝贵经验和理论基础。
（2）研究思路的创新：本试验研究基础体现了从整体至局部的逻辑，先研究SMAD蛋白家族在湖羊睾丸发育中的表达规律，再研究某些显著时间依赖性表达的SMAD蛋白的组织特异性，横行纵向开展研究后得到表达最具特异性的SMAD蛋白。再通过细胞体外培养技术阐明该蛋白对睾酮激素分泌的影响。
5. 研究计划与进展
| 研究计划 | |
| 时间区间 | 预期进展 |
| 2019.05 - 2019.08 | 收集、查阅、整理相关文献资料，写文献综述； 准备相关试验材料； 学习相关实验知识及技术。 |
| 2019.09 - 2019.10 | 采集不同日龄（3M、7M、9M、2Y）湖羊睾丸及其它组织，获得并鉴定出睾丸细胞。 |
| 2019.11 – 2019.12 | 研究SMAD2蛋白及其家族在湖羊睾丸发育中的表达规律。 |
| 2020.01 - 2020.02 | 明晰SMAD蛋白家族在湖羊不同组织中的表达特异性。 |
| 2020.03 - 2019.04 | 揭示SMAD2蛋白对睾丸间质细胞分泌睾酮的影响。 |
| 2020.04 - 2020.05 | 将所有实验数据进行统一整理、分析； 撰写毕业论文，办理有关结题事项； 准备毕业答辩。 |
