1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
猪链球菌(streptococcus suis, ss)是一种重要的人兽共患病原菌，该菌不仅给全球养猪业造成巨大的经济损失,还严重危害公众健康【1】。
根据荚膜多糖抗原的差异,猪链球菌可以分为33个血清型，其中血清2型(ss2)是世界范围内致病性最强,临床分离率最高的血清型，ss2感染猪会导致脑膜炎、败血症、关节炎、肺炎,甚至急性死亡；感染人会导致脑膜炎和链球菌中毒性休克综合征等【2】。
截止到2012年,人感染猪链球菌病例总数接近1600例,是2009年数据的两倍。
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标、内容和拟解决的关键问题研究的目标：构建猪链球菌2型强毒株ss2-1的clpc蛋白酶基因缺失株。
研究的内容：1.ss2-1 clpc基因敲除缺失株的构建 2.clpc基因敲除缺失株的鉴定； 3.balb/c小鼠致病性实验。
拟解决的关键问题：clpc对ss2毒力的影响。
3. 研究的方法与方案
研究方法：1.pcr扩增clpc同源臂基因片段；2. 构建重组敲除质粒；3.电转及筛选基因缺失株； 4.组合pcr及基因测序验证缺失株；5.利用balb/c小鼠确定缺失株的毒力；6.竞争感染实验。
技术路线：前期准备：引物的设计及合成；pcr扩增目的基因同源臂序列；构建重组敲除质粒；电转化进ss2-1感受态细胞；筛选和鉴定目的基因缺失株；clpc缺失株与亲本株的致病性比较；clpc缺失株与亲本株的竞争感染实验实验方案：1.pcr扩增目的基因片段，纯化、酶切、连接pset4s质粒、转化至感受态dh5α，挑取阳性克隆，测序鉴定重组缺失质粒；2.将缺失质粒电转化进ss2-1感受态细胞，筛选基因缺失株，组合pcr和基因测序进行鉴定；3.balb/c小鼠腹腔注射各不同浓度的ss2亲本株和缺失株，比较小鼠的存活率差异；4.等比混合两种菌液腹腔注射balb/c小鼠，24h后采集血液、脾、脑等器官，通过无抗性和抗性thb平板计数，计算竞争系数。
可行性分析：1.试验技术比较成熟，无技术难度；2.实习实验室具备试验所需仪器；3.工作时间有保证。
4. 研究创新点
本课题以新发现的ClpC蛋白酶为研究对象，构建基因缺失株，探讨基因缺失前后对细菌毒力的影响，为深入研究其在猪链球菌致病中的作用奠定基础。
5. 研究计划与进展
第1-5周（2017.9.4-2017.10.8），设计并合成PCR引物，构建重组敲除质粒第6-17周（2017.10.9-2017.12.31），筛选及鉴定缺失株，通过BALB/c小鼠模型测定毒力第18-19周（2018.1.1-2018.1.14），数据分析、整理，撰写论文。
