LysR的克隆与表达开题报告

1. 研究目的与意义

背景：

在涉及有机溶剂的工业生物催化和环境生物修复中，有机溶剂对于微生物的毒害作用是一个重要的制约因素。有机溶剂对于微生物有极大的毒害作用，微量的有机溶剂就可以对微生物生长造成巨大影响。人们普遍认为微生物无法在高浓度的有机溶剂中生存，直到1989年inoue等人报道了一株能耐受高浓度甲苯的微生物，打破了这一固有观念。此后，人们便开展了大量的工作筛选耐受各种高浓度有机溶剂的微生物，并逐渐深入了对于有机溶剂耐受机制的基础研究，取得了一系列的成果。

通过在不同类型的生态环境中筛选得到耐受不同有机溶剂的微生物，包括在废水处理厂中筛选出的能够耐受90%二甲苯的pseudomonas putida dot-t1、在莱茵河畔土壤中筛选出的能够耐受甲苯等有机溶剂的bacillus cereus rl、在农田土壤中筛选出的能够耐受苯乙烯、甲苯等有机溶剂的pseudomonas putida s12等等，其中以恶臭假单胞菌最为常见。另一方面，对于有机溶剂耐受机制的研究也较为深入。有机溶剂对于细胞的毒害作用主要是通过破坏细胞膜实现的，此外破坏基础代谢直接导致细胞死亡也是有机溶剂的一种毒害方式。而为了应对有机溶剂的毒害作用，不同菌株的耐受机制也各不相同。包括细胞壁的物理屏障、生物膜脂肪酸等组分的改变、有机溶剂的代谢和主动泵出系统等等，其中利用rnd型溶剂外排泵主动泵出有机溶剂是现如今被广泛接受的最主要的耐受机制。

2. 研究内容和预期目标

研究内容：

本论文主要内容是克隆并表达联苯降解基因簇的调节蛋白lysr。包括：

1.设计引物，利用基因组dna进行pcr，同时提取质粒pet-28a( )。

3. 研究的方法与步骤

研究方法：

利用表达宿主e.coli bl21(de3)，表达载体pet-28a( )和his₆-tag来表达蛋白lysr。

步骤包括：

4. 参考文献

[1]王洪涛, 王孝平, 玄光善. 有机溶剂耐受菌的研究进展[j]. 生物技术通报, 2008,(5):62-66

[2]王鑫昕, 王少华, 李维, 李寅, 张延平. 细菌的有机溶剂耐受机制[j]. 生物工程学报, 2009, 25(5):641-649

[3]刘雯雯. pseudomonas putida idaho有机溶剂耐受机理的研究. 硕士学位论文. 山东大学

5. 计划与进度安排

1. 2.20—3.12 查阅相关文献资料完成开题报告

2. 3.13—4.9 设计实验方案，做好实验前准备，包括设计引物，购买相关的分子试剂盒，制备大肠杆菌感受态等。

3. 4.10—5.14 进行实验，包括pcr，酶切，连接，转化，挑阳性克隆，送测序，转化表达宿主，诱导，进行表达检测等。