1. 研究目的与意义
ε-聚赖氨酸是由25~35个L-型赖氨酸单体通过α-羧基和ε-氨基连接而成的单一型氨基酸聚合物,其首先在日本被发现。该物质具有抗菌谱广、水溶性强、耐高温和易被人体降解的特性,同时拥有良好的安全性和生物可降解性,被广泛应用于食品和药物领域。目前,ε-聚赖氨酸已被多个国家广泛应用,日本已实现工业化,而我国的ε-聚赖氨酸生产仅处于实验室向生产过渡的初级阶段。因此,提高ε-聚赖氨酸产量具有重要的现实意义。
ε-聚赖氨酸产生菌主要是链霉菌,自然界筛选出的野生菌ε-聚赖氨酸产量普遍不高,为了克服这一障碍,在单因素分析的基础上通过正交试验优化了产ε-聚赖氨酸白色链霉菌的发酵培养基;通过响应面法优化了发酵培养基。本综合考虑碳源、氮源、无机盐、温度以及pH值的影响,运用响应面法对产ε-聚赖氨酸的发酵培养基进行优化,以期为其工业化生产提供理论依据。
2. 研究内容和预期目标
具体研究内容如下:
1)通过前期探究实验,挑选出培养基中对发酵影响最大的几种成分。
2)通过单因素实验,研究对白色链霉菌发酵影响最大的几种成分的浓度,并设置合适的高水平及低水平。
3. 研究的方法与步骤
培养方法:平板培养基、斜面培养基。
测聚赖氨酸的含量:甲基橙法(接种子液:1、用大枪头吸4ml生理盐水,加入菌种,用竹签搅拌到没有块状[打匀]。2、用小枪头吹打几次,吸取1000μl,加到种子培养液中,推平扎好,重复上述步骤[平行实验]。隔一天。接发酵液:1、用大枪头从锥形瓶中各取两管,事先摇匀后再吸,每次吸4ml,注入对应锥形瓶中,推平扎紧。2、重复上述步骤,做好对应标记。3、放入摇床,温度30℃,速度200rp/min。三天后取出锥形瓶,每个锥形瓶取9mlx2,加入离心管,离心,取上清吸0.5ml并加磷酸缓冲液9.5ml[相当于稀释20倍],取2ml稀释液与2ml甲基橙混合均匀,在水浴锅中30℃,震荡30min,4000rp/min离心15分钟后去沉淀,上清液稀释10倍。测od465[pbs为空白对照])
4. 参考文献
| [1]Shima S , Sakai H .Poly-L-lysine produced by Streptomyces .PartIII .Chemical studies[ J] . Agric.Biol .Chem .,1981(45):2503~2508 . [2]史应武, 娄恺, 李春.ε-聚赖氨酸的生物合成与降解及其应用研究进展[ J] .中国农业科学, 2009 , 42(3):1009~1015 .
[3]Shih I L , Shen M H , Van Y T .Microbial sy nthesis of poly(ε-lysine)and its various applications [ J] .Bioresour Technol , 2006(97):1148~1159 . [4]Mousazadeh M , Palizban A , Salehi R , et al .Gene delivery to brain cells with apoprotein E derived peptide conjugated to polylysine (apoEdp-PLL)[ J] .Journal of Drug Targeting , 2007 , 15(3):226~230 . [5]Volodkin D , Mohwald H , Voegel J C , et al .Coating of negatively charged liposomes by polylysine:Drug release study[ J] .Journal of Con trolled Release , 2007 , 117(1):111~120 . [6]Yoshida T , Nagasawa T .Poly-l-lysine :Microbial production biodegradation and application potential[ J] .Appl Microbiol Biotechnol , 2003(62):21~26 . [7]Shih I L , Van Y T , Shen M H .Biomedical applications of chemically and microbiologically synthesized poly(glutamic acid) and poly(lysine)[ J] .Mini .Rev.Med .C hem ., 2004(4):179~188 . [8]Plackett R L, Burman J P .The design of optimum multifatorial experiments[ J] .Biomet rika, 1946(37):305~325 . [9]ltzhaki R F .Colorimetric method for estimating poly-lysine and poly-arginine[ J] .Anal Biochem .,1972(50):569~574 . [10]Kahar P, Iwata T , Hiraki J , et al .Enhancement of ε-polylysine production by Streptomyces albulus strain 410 using pH control [ J] .Journal of Bioscience and Bioengineering , 2001 , 91(2): 190~194 . [11] Shima S, Sakai H. Polylysine produced by Streptomyces[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1977, 41: 1807-1809. [12] 贾士儒, 许春英, 谭之磊,等. ε-聚赖氨酸产生菌 TUST-2 的分离鉴定[J]. 微生物学报,2010, 50 (2): 191-196. [13] 谢建飞,杨玉红,陈红漫,等. 防腐型乳化剂葡聚赖氨酸的研究[J]. 食品科学,2009, 30(11): 131-133. [14] 李树, 陈旭升, 廖莉娟, 等. ε-聚赖氨酸产生菌的筛选方法改进[J]. 食品与生物技术学报,2010, 29(2): 282-287. [15] Li S, Tang L, Chen XS, et al. Isolation and characterization of a novel ε-poly-L-lysine producing strain: Streptomyces griseofuscus[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2011, 38: 557-563. [16] Shima S, Oshima S, Sakai H. Biosynthesis of ε-poly-L-lysine by washed mycelium of Streptomyces albulus No346[J]. Nippon Nogeikagaku Kaishi, 1983, 57: 221-226. [17] 李荣杰. 微生物诱变育种方法研究进展[J]. 河北农业科学,2009,13(10):73-76, 78. [18] 张玲华,田兴山. 微生物空间诱变育种的研究进展[J]. 核农学报,2004, 18(4):294-294. [19] 张海涛,李燕,欧杰,等. 诱变选育 ε-聚赖氨酸菌产生菌突变株[J]. 食品科学,2007, 28(09): 398-401. |
5. 计划与进度安排
1)2016-03-04~2016-03-10:查阅资料撰写开题报告;
2)2016-03-11~2016-03-16:斜面培养基制备与菌种的活化;
3)2016-03-17~2016-04-01:通过前期探究实验,筛选发酵培养基成分的关键因子;
