1. 研究目的与意义
背景：
东方鲀属系fugu为鲀科鱼类的一属，一般体长在100~300毫米左右，大的可达630毫米以上。体亚长椭圆形,尾部稍侧扁。头宽而圆，每侧具2个鼻孔，鼻突起呈卵圆形。体侧具皮褶，体被小刺或光滑。背鳍1个，无鳍棘,具鳍条11~19，前方2~6鳍条不分支，臀鳍与背鳍相似,具鳍条9~16,前方1~6鳍条不分支;尾鳍圆形或截形，有时稍凹入。鳔呈卵圆形或椭圆形。有气囊。个体变异大，颜色花纹多种多样，有些种类不同大小个体的体色有变异。东方鲀属主要分布于中国、日本及朝鲜，苏联远东太平洋区，菲律宾及印度尼西亚，次之，个别种达东非及澳大利亚，种类约有200余种，其中在我国就有16种，沿海南北都有分布。黄渤海及东海种类较多,各有14种；南海较少，仅7种。产于中国的16种有5种为仅见于中国的地方种。
该属鱼类因其味道鲜美，而有“鱼中之王”的美誉，历来具有很高经济价值，并引起研究者们的高度关注。而虽然其肉味鲜美，脂肪和蛋白质含量都很高，但其皮肤、生殖腺、肝、血液中含有毒素。河豚毒素即ttx，具有镇痛、局麻、解痉等多方面的药理作用，而且患者不会成瘾，因而具有很高的药用价值，随着人们对其研究的深入，进入临床广泛使用指日可待。
2. 研究内容和预期目标
本文选取线粒体atp6基因进行研究，采用pcr扩增的方法，从暗纹东方鲀肝肌肉组织线粒体细胞中克隆atp6基因序列并进行测序，经过生物信息学软件分析比较暗纹东方鲀的atp6基因序列与已知的鲀类序列的同源性程度，同时通过基因组相似序列的搜索，以及运用特征分析基因维序列，对我们研究物种之间的关系、生物进化和系统发生分析等有很大的帮助。
主要研究内容：（一）鲀科鱼类基因组dna的提取（二）暗纹东方鲀线粒体atp6基因的克隆和鉴定；（三）鲀属鱼类atp6基因序列分析以及系统进化树的构建。
3. 研究的方法与步骤
（一）线粒体基因组DNA的提取和纯化；
1.1 实验材料和主要试剂
-80℃冰箱保存的鲀科鱼类的肌肉和肝脏组织。
DNA凝胶回收试剂盒
质粒DNA小量试剂盒
T Vector pMD 19(simple)(50ng/μL)
蛋白酶K
EcoRⅠ 、HindⅢ
PMD19—T Vector
1.2 方法
采用酚-氯仿抽提法进行提取。
取冻存的肌肉细胞0.2克，剪碎，放入玻璃匀浆器中，加入800L抽提缓冲液，在冰上充分匀浆（所有过程均在冰上进行）。将匀浆液收集到1.5毫升的离心管中，每管分装约500L。先将150L的10%SDS加入至离心管中，后将50L的10mg/mL的蛋白酶K加入至离心管中，充分混匀，37℃水浴过夜，至液体清澈透明。
向液体中加入苯酚溶液，4℃，3000rpm抽提8分钟。 将上清液移到一个新的离心管中，加入700L氯仿，混匀。 4℃，3000rpm，抽提 8 分钟。将最上层水相移入新的洁净的离心管中，加入十分之一 NaAc混匀。 加入 2.5 倍体积的无水乙醇，冷藏保存过夜。
4℃，12000rpm ，离心15分钟。弃上清，用70%乙醇将DNA 沉淀洗涤2次，5000rpm 离心收集DNA。室温干燥，加入50L的无菌水，轻轻混匀，冷藏保存。 用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
（二）目的片段PCR扩增，鉴定、测序；
2.1 扩增目的条带
PCR反应体系的构建
预混体系 12.5μl
引物（上下游） 各1μl
模板 1μl
ddH2O 9.5μl
PCR反应程序
| 预变性 | 95°C | 5min |
| 变性 | 95°C | 30s |
| 退火 | 57°C | 30s |
| 延伸 | 72°C | 1min |
| 经过35个循环 | ||
| 延伸 | 72°C | 10min |
| 温度降低至4°C保持一段时间 |
PCR 扩增结束后，用移液枪将全部体系吸取出来进行琼脂糖凝胶电泳。产物跑胶后切胶回收目的条带。
2.2 TA克隆
将切胶回收的目的产物、Solution I、PMD19—T Vector构建10μL的连接体系。将连接好的质粒转化制备好的感受态细胞中。培养，涂平板。观察有无单克隆菌落，发现培养基上有蓝白斑的产生，选择周围无杂菌的白色单菌落进行挑斑，筛选重组子。
2.3扩培
每个培养皿中挑取8-10个目的单克隆菌落加入试管扩大培养。
2.4鉴定及测序
质粒DNA小量试剂盒抽提质粒。从提取的质粒中分别取少量用HindⅢ和EcoRⅠ进行单酶切、双酶切。最后质粒、单酶切、双酶切电泳跑胶。结果符合预期，测序。
（三）ATP6序列及分子进化分析。
根据鲀科线粒体ATP6的序列，在数据库中选择几种同科鱼类的线粒体DNA ATP6部分序列，并进行比对，计算不同序列间的差异性和碱基组成比对；采用NJ构建分子系统树。系统树各分支的置信度由1000次自举法重复检测。
4. 参考文献
[1]张佳峰，吴娥娇，罗桂火，等.致病疫霉 atp6 基因单倍型与地理因素的相关性分析［j］.江苏农业科学，2017，45(8) : 75 － 78.
[2]王玉玉.脉翅总目昆虫比较线粒体基因组学及系统发育研究［d］.中国农业大学博士学位论文.
[3]邵爱华，杜建，陈葵.暗纹东方鲀线粒体atpase6和atpase8基因的克隆与序列分析[j].苏州科技学院学报(自然科学版)，2010，27(1)：41-46.
5. 计划与进度安排
（1）2022-2022-1学期17-20周---2022-2022-2学期第1周（2022-3-11），接受任务书。查阅资料，确定所选基因，准备开题报告，外文论文翻译。
（2）第2周~第4周（2022-3-12~4-1）综合相关文献资料，撰写开题报告，原材料制备，完成实验前准备工作，配制各实验所需药品；学习提取鱼的基因组dna和扩增线粒体atp6基因。学会使用pcr仪，对pcr反应体系，循环参数进行摸索和调整等措施，学会制胶，学习制备感受态细胞，pcr目的基因。
（3）第5周~第12周（2022-4-2~5-27）完成pcr扩增产物的鉴定与割胶回收，回收纯化产物与载体连接，转化到感受态细胞中，利用白斑筛选阳性克隆，用质粒dna小量试剂盒提取质粒，用双酶切鉴定阳性菌落，阳性菌落质粒dna送到生物公司进行测序。
