1. 研究目的与意义
本世纪以来，由于分子生物学研究技术的迅猛发展，物种进化和发育的研究不断深入，基于dna水平的分子标记应用最为广泛。在物种水平上，利用分子标记方法进行研究，可以改变传统的理解物种的方法；在系统层次上研究，则是应用一些分子标记技术来构建系统树。
线粒体dna（mitochondrial dna，简称mtdna），是真核生物核外遗传系统，其结构简单，进化速率较快，编码效率高，已成为鱼类分子系统研究的重要分子标记，在群体遗传结构，地理变异，系统发育等研究领域应用广泛。线粒体基因组中的一些基因是系统发育研究的热点基因。
nadh-coq脱氢酶（nadh-coqdehydrogenase）由至少34个蛋白亚基构成，其中有6个亚基由mtdna编码，nd4,nd5是其中的两个，这2个基因进化速率适中，是种属系统发育研究的良好标记。同时，nadh-coq脱氢酶是生物氧化过程中电子传递链的重要组成部分，参与fmn和nadh之间的电子传递反应。
2. 研究内容和预期目标
研究内容：
1、暗纹东方鲀线粒体基因组dna的分离方法优化；
2. 目的基因的克隆和鉴定；
3. 研究的方法与步骤
一、采用酚-氯仿抽提法提取暗纹东方鲀总DNA
1、分别取冻存的肌肉细胞和肝脏细胞 0.2 克，剪碎，放入玻璃匀浆器中。
2、加入 800L 抽提缓冲液，在冰上充分匀浆（所有过程均在冰上进行）。
3、将匀浆液收集到 1.5 毫升的离心管中，每管分装约 500L，直至全部转移至离心管中。
4、用移液枪将150L的20%SDS加入至离心管中，后将50L的10mg/mL的蛋白酶K加入至离心管中，轻轻将酶混入溶液后，充分混匀。
5、将其放入恒温水浴锅中，在 37℃下水浴 8 小时，液体变得澄亮之后，
将其拿出冷却至室温。
6、在离心管中加入等体积苯酚溶液（即 700L），混匀，放入台式冷冻离心机中于 4℃，3000rpm下抽提8分钟。
7、用移液枪将上清液移到一个新的离心管中，之后在离心管中加入相等体积氯仿溶液，将混合液轻轻混匀。
8、混匀后将其放入台式冷冻离心机中，设置 4℃，3000rpm，在此情况下抽提8分钟。
9、小心地将最上层水相移入新的洁净的离心管中（共360L）。
10、加入十分之一NaAc溶液（即36L）混匀。
11、在离心管中加入 2.5 倍体积即 990L 的无水乙醇，冷藏保存过夜。
12、第二天将其放入台式冷冻离心机中，设置 4℃，转速12000rpm的情况下离心15分钟。
13、弃上清，用70%乙醇将DNA沉淀洗涤2次，5000rpm分钟离心收集DNA。
14、于室温干燥，加入50L的无菌水，轻轻混匀，冷藏保存。取适量进行电泳鉴定。
二、目的基因ND4的同源克隆
（一）PCR克隆目的基因
1、从Genbank调取红鳍东方鲀的ND4基因序列，设计上下游引物以备用于暗纹东方鲀的同源克隆。
2、构建PCR反应体系：
| 组分 | 含量（L） |
| 2× PCR 缓冲液
| 12.5 |
| 上游引物 | 1 |
| 下游引物 | 1 |
| 模板DNA | 2.5 |
| ddH2O
| 14 |
| 总体积 | 31 |
3、PCR反应程序：
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 5min |
| 变性 | 95℃ | 30s |
| 退火 | 55℃ | 30s |
| 延伸 | 72℃ | 60s |
| 经35个循环 | ||
| 延伸 | 72℃ | 10min |
| 4℃保存 |
4、PCR扩增结束后，用移液枪取6L进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。若鉴定出目的扩增片段则进入下一步，否则重新扩增。
5、剩余25L体系在琼脂糖凝胶电泳分离后，用TaKaRa凝胶回收试剂盒割胶回收扩增片段。
（二）感受态细胞的制备
1、在超净工作台桌面上喷洒70%乙醇擦拭，后开紫外灯灭菌30min左右。
2、取两支无菌的摇菌试管，在无菌操作环境下，往试管中分别加入 3 ml不含抗菌素的 LB 培养基。
3、从冰箱中取出DH5菌种，放置在冰上。在超净工作台中用无菌枪头吸取 20L 菌液，加入到含有3ml LB 培养基的试管中，放入恒温摇床中，设置37℃，培养过夜。
4、用移液枪和无菌枪头取 1ml上述菌液移入含有 50ml LB 培养基的三角烧瓶中，放入恒温摇床中，设置 37℃，转速 250rpm，培养 3 个小时。
5、在无菌的操作环境下，将活化的菌液加入到 1.5 毫升的已预冷的离心管中，在冰上放置 10 min，然后放进台式冷冻离心机中，设置 4℃，转速5000rpm 下进行离心，时间为 10 min。
6、离心后去上清液，在保留沉淀的离心管中加入 1 毫升冰冷的 0.1 mol/LCaCl2 溶液后，立即颠倒混匀。将混匀后的溶液插入冰块中放置 30 分钟。之后放入台式冷冻离心机中，设置 4℃，转速 5000rpm 下进行离心，时间为 10 min。
7、去上清液后，用移液枪吸取 200μL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2 溶液来重悬菌体。之后得到的感受态细胞可以直接用作转化实验或者加入甘油保存于-80℃冰箱。
（三）目的基因片段与载体的连接
取一个灭菌的 0.2 毫升离心管，在里面加入
| 组分 | 含量（L） |
| 10× Buffer | 1 |
| 50%PEG | 1 |
| pMD-T 载体 | 1 |
| DNA 回收产物 | 6 |
| T4 DNA Ligase（4U/vl） | 1 |
| 总体积 | 10 |
将混合液轻轻振荡后再短暂离心，然后放入温度为 16℃的恒温培养箱中，保温过夜。连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞，或放入 4℃冰箱备用。
（四）转化
1、将 LB 固体培养基放入恒温水浴锅中加热融化后，拿出，在室温下冷却至 50℃左右，在超净工作台上加入 200μL /100mL 的氨苄青霉素到 LB 培养基中，用已经高温蒸汽灭菌过的培养皿倒平板，倒好后静置。
2、取两支新鲜制备的感受态细胞置于冰上，然后用移液枪轻轻地将细胞均匀悬浮。
3、在感受态细胞中各加入 5L 连接液，轻轻混匀。
4、将其在冰上放置 30 分钟，每隔 10 分钟将其轻轻弹匀再放在冰上。
5、在恒温水浴锅中，温度 42℃下，水浴热激 90 秒。
6、在冰上放置 3 分钟。
7、然后在其中加入 800L 的 LB 培养基，在 37℃，转速 220rpm 的情况下扩培 1 小时。
8、将其放进台式离心机中，设置转速 4000rpm 进行离心，时间为 5 分钟。后用移液枪小心地去掉 900L 上清液，接着将细胞悬浮。
9、加入 40μL X-gal 和 7L IPTG 混匀。
10、全部混匀后用无菌枪头吸取溶液后，放置于培养皿中心，接着用玻璃涂布棒先在酒精灯上灭菌，冷却后将溶液均匀涂布在上述平板培养基上。
11、将涂布后的培养皿放入恒温培养箱中，设置 37℃，先正置 1 小时，然后再倒置培养过夜（约 15 小时）。
12、观察转化产物的涂布平板和培养后的结果，观察有无单克隆菌落。发现培养基上有蓝白斑的产生，选择周围无杂菌的白色单菌落进行挑斑。
（五）阳性克隆的筛选
1、在超净工作台上，在 3 支含有 3 毫升 LB 培养基的无菌试管中分别加入6L 氨苄青霉素（含 50g/mL 氨苄青霉素），用记号笔写好编号。
2、在超净工作台中，使用移液枪的无菌枪头尖部，轻轻挑起转化的平板培养基上的一个单独的、周围无杂菌的白色菌落，然后将枪头直接隔空打入盛有 3 毫升 LB 培养基（含 50g/mL 氨苄青霉素）的试管中。用这个方法随机选取3个周围无杂菌的、单独的白色菌落分别装入 3 个试管中。
3、将 3 支摇菌管塞好棉塞，用毛线和牛皮纸包扎捆绑在一个玻璃瓶中，并用棉花和报纸等固定住，将其放置于恒温摇床中，于 37℃，转速 220rpm 下摇菌扩培 6 个小时。
（六）质粒抽提与酶切鉴定
1、用质粒DNA小量试剂盒提取质粒
2、用双酶切鉴定阳性菌落
酶切体系的构建：
| 组分 | 含量（L） |
| 抽提的载体质粒 DNA | 8 |
| 10× 酶切buffer | 2 |
| HindⅢ | 0.5 |
| EcoRⅠ | 0.5 |
| ddH2O | 9 |
| 总体积 | 20 |
再放入台式离心机中以 1000rpm 离心 10 秒。取出后插到离心管架中，放入恒温水浴锅中，在 37℃下水浴 2 个小时。之后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
3、剩下的阳性菌落质粒DNA送到生物公司进行测序。
三、鲀属鱼类ND4和ND5基因序列分析以及系统进化树的构建
从Genbank调取若干种鲀科动物的ND4、ND5基因序列，结合已经测序得到的暗纹东方鲀的ND4基因序列，整理实验数据，用ClustalX，MEGA等软件对所测序列编辑、排序，并且采用Kimura双参数法模型计算遗传距离，构建系统树（NJ树）。
4. 参考文献
[1]刘丽, 刘楚吾, 张明辉, 等. 不同保存条件下鱼类组织基因组 dna的提取效果分析[j]. 广东海洋大学学报, 2007, 27(6):19-22.
[2]肖武汉, 张亚平. 鱼类线粒体 dna的遗传与进化[j]. 水生生物学报, 2000, 24(4): 228-236.
[3]郭新红, 刘少军, 刘巧, 等. 鱼类线粒体dna研究新进展[j]. 遗传学报,2004 , 31(9) : 983- 1000.
[4]takashi p. satoh, masaki miya, kohji mabuchi,et al. structure and variation of the mitochondrial genome of fishes [j]. 2016, bmc genomics, 17:719-739.
5. 计划与进度安排
（1）2022-2022-1学期17-20周---2022-2022-2学期第1周（2022-3-11）：接受并阅读任务书。查阅资料，了解所选基因nd4和nd5的基本情况，准备开题报告，外文论文翻译。制定试验计划与每日安排。
（2）第2周~第4周（2022-3-12~4-1）：综合相关文献资料，撰写开题报告，原材料制备，完成实验前准备工作，配制各实验所需药品；学习提取鱼的基因组dna和扩增线粒体nd4基因。学会使用pcr仪，对pcr反应体系，循环参数进行摸索和调整等措施；学会制胶，学会凝胶电泳与电泳染料成像技术，学习制备感受态细胞，pcr目的基因。
（3）第5周~第12周（2022-4-2~5-27）：完成pcr扩增产物的鉴定与割胶回收，回收纯化产物与载体连接，转化到感受态细胞中，利用蓝白斑筛选阳性克隆，用质粒dna小量试剂盒提取质粒，用双酶切鉴定阳性菌落，阳性菌落质粒dna送到生物公司进行测序。
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