暗纹东方鲀线粒体ND2基因克隆及序列分析开题报告

1. 研究目的与意义

鲀科属鲀形目下的1科，通称鲀。个别种如鲀属有些体长可达900毫米。体粗短或亚长椭圆形。头及吻宽钝。主要分布于太平洋、印度洋和大西洋热带。一般栖息在近海及咸淡水中，有些能进入江河，也有少数鲀属的种类仅生活与淡水内。有16属约118种，。我国的鱼类学家成庆泰等人在1975年系统地研究了分布于我国的15种东方鲀属鱼类的分类及种类关系

中国有东方鲀属鱼16种，沿海南北都有分布。黄渤海及东海种类较多,各有14种；南海较少，仅7种。产于中国的16种有 5种为仅见于中国的地方种。常见的种类如红鳍东方鲀,为本属鱼类中价值最高的1种；虫纹东方鲀；条纹东方鲀。河豚肉鲜美，但内脏含有一种剧毒的毒素，称河豚毒素。河豚毒素有用于治疗神经系统疾病和止血、止痛。腌藏和干制品可供食用;鲜鱼去掉皮、内脏及血等后,亦可食用。

线粒体基因组作为一种核外遗传系统，具有小型性，自主性和多态性等特点。有关线粒体基因组的研究将有利于研究诸如基因结构与功能、基因表达的时空调控、核质互作、分子进化规律、物种的起源与分化以及线粒体的起源等生物学重要课题，陈四海等学者研究发现其解码体系相对简单，编码效率高，拷贝数多，进化速度快，在鸟类、鱼类和两栖类动物的分子系统学研究中得到了广泛的应用，已成为群体遗传结构，地理变异，系统发育等研究领域有效的分子标记。2006年李耀东等研究发现mtdna不同区段的基因序列进化速率不一样。

nadh脱氢酶亚单位1(nadh dehydrogenase subunit1)基因和nadh脱氢酶亚单位2(nadh dehydrogenase subunit2)基因是线粒体dna(mtdna)的两个蛋白编码基因，它们是nadh脱氢酶的两个亚基在呼吸链中直接参与氢与电子传递并通过氧化磷酸化产生atp，进而参与能量代谢作用。线粒体nd2基因进化速率相对较快。近年来，nd2基因在鸟类、鱼类和两栖类动物的分子系统学研究中得到了广泛的应用，充分显示出其良好的分子标记特性。在核酸分子水平上对鱼类进行种质鉴定、多样性评估，并探讨它们的亲缘关系和系统演化，是目前鱼类遗传育种、资源评估和起源进化研究最有效的手段。

2. 研究内容和预期目标

本文拟选取线粒体nd2基因进行研究，采用pcr方法，从暗纹东方鲀肌肉组织线粒体细胞中克隆nd2基因序列并测序，经过生物信息学软件分析比较暗纹东方鲀的nd2基因序列与已知的鱼类序列的同源性程度，同时通过系统发育分析方法对nd2的基因序列结构作相应分析，为进一步研究nd2的功能提供实验数据。

主要研究内容：

（一）暗纹东方鲀线粒体基因组dna的提取。

3. 研究的方法与步骤

（一）、暗纹东方鲀线粒体基因组的提取

1.1实验所需的试剂和材料

-80℃冰箱保存的鲀科鱼类的肌肉和肝脏组织、dna凝胶回收试剂盒、质粒dna小量试剂盒、t vector pmd 19(simple)(50ng/μl)、蛋白酶k、ecorⅠ 、hindⅢ、pmd19—t vector

4. 参考文献

[1] 肖武汉, 张亚平. 鱼类线粒体dna 的遗传与进化[j]. 水生生物学报, 2000, 24(4): 228-236.

[2] christian elmerot, ulfur arnason, takashi gojobori, et. the mitochondrial genome of the pufferfish, fugu rubripes, andordinal teleostean relationships[j]. gene, 2002 ,295: 163–172.

[3] 郭新红, 刘少军, 刘巧, 等. 鱼类线粒体dna 研究新进展[j]. 遗传学报, 2004 , 31(9) : 983- 1000.

5. 计划与进度安排

（1）2022-2022-1学期17-20周---2022-2022-2学期第1周（2022-3-11），接受任务书。查阅有关暗纹东方鲀的资料，确定所需测序的基因，构思开题报告，帅选有关鲀科鱼类的外文文献。

（2）第2周~第4周（2022-3-12~4-1）撰写开题报告，配制实验所需药品和试剂；采用酚氯仿法提取鱼的基因组dna。学习琼脂糖凝胶电泳的步骤包括如何制胶和配制电泳缓冲液，使用pcr仪扩增所提取的目的基因并构建pcr反应体系，学习制备感受态细胞。

（3）第5周~第12周（2022-4-2~5-27）确定pcr扩增最适的退火温度和完成pcr扩增产物的鉴定与切胶回收，采用试剂盒法纯化产物，目的基因片段与载体连接，转化，利用白斑筛选阳性克隆，用质粒dna小量试剂盒抽提质粒，用双酶切鉴定阳性菌落，阳性菌落质粒dna送到生物公司进行测序。