暗纹东方鲀线粒体ND6基因克隆及序列分析开题报告

鲀科鱼类起源于暖水性热带海洋水域，随种的分化演变，向温冷水海域和内陆淡水水域扩散分布，它们被认为是硬骨鱼类中最进化、最特化的类群个体变异大，颜色花纹多种多样，有些种类不同大小个体的体色有变异。主要分布于中国、日本及朝鲜，苏联远东太平洋区，菲律宾及印度尼西亚。中国有东方鲀属鱼约16种，沿海南北都有分布。黄渤海及东海种类较多，南海较少。产于中国的16种有5种为仅见于中国的地方种。常见的种类如红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)、虫纹东方鲀(Takifugu vermicularis)、条纹东方鲀（Takifugu xanthopterus）等。暗纹东方鲀（T. fasciatus）为本属鱼类中价值最高的种类之一。暗纹东方鲀肉质鲜美，具有较高的经济和研究价值，其内脏含有一种毒素，称河豚毒素，可用于治疗神经系统疾病和止血、止痛具有很高的经济价值。

线粒体基因组作为一种核外遗传系统，具有小型性，自主性和多态性等特点。学者研究发现其解码体系相对简单，编码效率高，拷贝数多，进化速度快，在鸟类、鱼类和两栖类动物的分子系统学研究中得到了广泛的应用，已成为群体遗传结构，地理变异，系统发育等研究领域有效的分子标记。关于水生生物线粒体ND6基因的报道相对比较少。

本研究参考改进了鱼类基因组DNA分离纯化的方法，克隆鱼类分子系统学研究中的分子标记线粒体ND6基因。研究成果将为探索东方鲀科间的分子遗传距离和相对亲缘关系，为进一步深入研究鱼类线粒体基因组的结构与功能、鱼类分子进化、种群间的联系、物种之间的亲缘关系等提供基础性的实验数据。

在核酸分子水平上对鱼类进行种质鉴定、多样性评估，并探讨它们的亲缘关系和系统演化，是目前鱼类遗传育种、资源评估和起源进化研究最有效的手段。本文拟选取线粒体ND6基因进行研究，采用PCR方法，从暗纹东方鲀肝组织线粒体细胞中克隆ND6基因序列并测序，经过生物信息学软件分析比较暗纹东方鲀的ND6基因序列与已知的鱼类序列的同源性程度，同时通过系统发育分析方法对ND6的基因序列结构作相应分析，为进一步研究ND6的功能提供实验数据。

主要研究内容：1、暗纹东方鲀基因组DNA的分离方法优化；

2. 目的基因ND6的克隆和鉴定；

3. 鲀属鱼类ND6基因序列分析以及系统进化树的构建。

预期目标：1、提取所需要的暗纹东方鲀目的基因。

2、对目的基因进行PCR扩增并进一步纯化。

3、目的基因序列分析和结果分析。

1 实验材料和试剂：

选取暗纹东方鲀，活体解剖取肝脏或肌肉，用STE缓冲液漂洗后，-80℃保存备用。

试剂：蛋白酶K、EcoRⅠ HindⅢloading Buffer 0.1mol/L氯化钙溶液 DNA抽提缓冲液3mol/L NaAc溶液(PH4.8) 75%乙醇 10%SDS 蒸馏水 苯酚 氯仿 无水乙醇 琼脂糖 50xTAE

仪器：移液枪及枪头 烧杯 研钵量筒 灭菌瓶 EP管 电泳槽 PCR仪超净工作台 离心机 酒精灯

2 步骤

2.1目的基因的提取

取适量暗纹东方鲀肌肉组织于研钵里研磨，然后移入匀浆器，加入1000ul缓冲液，充分磨匀，然后转入两只1.5mL 离心管中，分别装500uL，加入150uL的10%SDS和50uL蛋白酶K以加入蛋白质的变型和裂解。放入37℃的恒温水浴锅中直至EP管中的组织液澄清透明后取出冷却至室温。

在离心管中加入水饱和酚700uL，放入台式冷冻离心机4℃ 4000rmp离心 8min，吸取上清液于新的离心管中，加入等体积的氯仿700uL，同上，吸取上清液于新的离心管中，加入NaAc36uL和无水乙醇990ml并保存过夜。

将离心管放入台式冷冻机中4℃ 12000rmp 15min，弃清液，用70%的乙醇吹打两到三次(约150uL)，于离心机中5000rmp离心10min，取出离心管要将管中的乙醇尽量蒸发干净，若有残留会DNA的纯度，待完全干燥后加入49uLd的灭菌水，轻轻混匀，取适量进行电泳鉴定。

2.2PCR扩增产物的回收与纯化

2.2.1PCR反应体系的构建

PCR反应程序：PCR预混体系2xPCR Master: 12.5ul

菌体模板: 1ul

上游引物F: 1ul

下游印引物R: 1uL

双蒸水: 9.5ul

35个循环

①预变性 95℃ 5min ②变性 95℃ 30S ③退火 59℃ 30S ④延伸 72℃ 30S ⑤延伸 72℃ 10min ⑥4℃保存

PCR结束后，先取5ul进行鉴定条带，再将其余样品进行回收纯化

2.2.2感受态细胞的制备

在超净工作台中进行接菌，取出冷冻的Top10放置在冰上，用无菌枪头吸取20ul菌液加入含有50mL LB培养基的锥形瓶中，37℃200rpm摇床过夜，取出锥形瓶中1mL菌液加入含有3mL LB培养基的试管中，37℃200rmp。将菌液分装到1.5mL离心管中于冰上放置10min，于4℃,5000rmp下离心10分钟，弃去离心管中的上清液，加入冰冷的氯化钙溶液，立即颠倒混匀，在冰上放置30min后于4℃,5000rmp下离心10分钟，弃去上清液，用200uL冰冷的氯化钙溶液重悬(即用移液枪吹打)菌体。

2.2.3 转化

在200uL的EP管中加入SolutionI 5uL、胶回收产物4.5uL、载体Pmd19-T Vector 0.5uL ，将离心管放入16℃的恒温水浴锅过夜，用来转化感受态细胞。

2.2.4 扩培

选择有白色单一菌落的进行挑斑加入到含有氨苄的LB培养基进行过夜摇床培养

2.2.5 抽提

质粒DNA小量试剂盒抽提质粒。从提取的质粒中分别取少量用HindⅢ和EcoRⅠ进行单酶切、双酶切。最后质粒、单酶切、双酶切电泳跑胶。结果符合预期，测序。

(二)鲀目鱼类ND2基因序列分析以及系统进化树的构建。

选取2个经鉴定的重组质粒送生物工程有限公司测序。根据暗纹东方鲀线粒体ND2的序列，在GenBank数据库中选择几种同目鱼类的mtDNA ND2部分序列，用MEGA6进行比对，计算不同序列间的差异性和碱基组成比对；用MEGA软件基于Kimura 2-parameter距离采用邻接法(NJ)构建分子系统树。系统树各分支的置信度由1000次自举法重复检测。

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（1）2022-2022-1学期17-20周---2022-2022-2学期第1周（2022-3-11），接受任务书。查阅资料，确定所选基因，准备开题报告，外文论文翻译。

（2）第2周~第4周（2022-3-12~4-1）综合相关文献资料，撰写开题报告，原材料制备，完成实验前准备工作，配制各实验所需药品；学习提取鱼的基因组DNA和扩增线粒体ND6基因。学会使用PCR仪，对PCR反应体系，循环参数进行摸索和调整等措施，学会制胶，学习制备感受态细胞，PCR目的基因。

（3）第5周~第12周（2022-4-2~5-27）完成PCR扩增产物的鉴定与割胶回收，回收纯化产物与载体连接，转化到感受态细胞中，利用白斑筛选阳性克隆，用质粒DNA小量试剂盒提取质粒，用双酶切鉴定阳性菌落，阳性菌落质粒DNA送到生物公司进行测序。

（4）第13周~第16周（2022-5-28~6-24），整理实验数据，用ClustalX，MEGA等软件对所测序列编辑、排序；并且采用Kimura双参数法模型计算遗传距离，构建系统树（NJ树）。撰写论文，毕业论文工作相关材料的完善。

（5）第17周（2022-6-18~6-22），完成论文后按要求及时提交所有材料，包括定稿、英文翻译、原始数据记录本等，参加毕业论文答辩。