刺糖多孢菌中甲基转移酶基因的过表达研究开题报告

1. 研究目的与意义

1.研究背景

化学农药自诞生以来，在农林害虫的防御和治疗中作出了巨大的贡献，因此保证了农林业的丰产和稳产。但是传统化学农药的不断追加和非理性施用在为农业生产带来飞速发展的同时，给生态环境造成的污染和破坏也因此与日俱增。随着各国对环境保护的日益重视，人们积极提倡生态农业，保护生态环境和确保人类健康安全，已成共识。为了实现农林业的可持续发展，就必须提出一种选择性高、靶标性强、易于降解、不易积累、效价高、污染小、对人畜毒性小、环境兼容性好、病虫害不易产生抗性等更高要求的农药。所以，进行农药品种的更新换代成为近年来农药研发的热点，生物农药在研究和应用上也必将有一个新的飞跃，前景也是十分广阔的。随着生物农药的出现，它正在悄然的在农业农药环境的三极关系中寻找平衡以代替原来农业与农药的两极关系向。

2.研究意义

2. 研究内容和预期目标

1.研究内容

（1）通过代谢工程策略，对多杀菌素合成途径中涉及到鼠李糖、福乐糖胺甲基转移酶和福乐糖胺转移酶编码基因spnk、spns和spnp构建表达载体，实现过表达。

（2）对工程菌进行摇瓶发酵，测定发酵产量。

3. 研究的方法与步骤

（1）提取基因组dna：将刺糖多孢菌的孢子接种到lb液体培养基中，28 ℃，200 rpm培养72 h，用于提取基因组dna。

（2）基因克隆的pcr反应：设计一对dna引物扩增spnk、spns、spnp基因。

（3）琼脂糖凝胶电泳：根据dna分子量大小确定胶浓度，称取对应浓度下的琼脂糖，加入适量1×tae缓冲液，将其煮沸，冷却至60 ℃左右时加入适量eb染色剂，混匀，倒入制胶板中，待其凝固后放入电泳槽中，用1×tae作为电泳缓冲液，将dna样品与上样缓冲液混合，加入到琼脂糖凝胶的点样孔中，在100 v电压下进行电泳，取出胶板对dna条带进行观察和分析。

4. 参考文献

[1]. xu, y., et al., enhanced lincomycin production by co-overexpression of metk1 and metk2 in streptomyces lincolnensis. journal of industrial microbiology biotechnology, 2018. 45(5): p. 345-355.

[2]. dziggel, c., h. schfer and m. wink, tools of pathway reconstruction and production of economically relevant plant secondary metabolites in recombinant microorganisms. biotechnology journal, 2017. 12(1): p. 1600145.

[3]. lu, c., et al., metabolomics analysis of the effect of dissolved oxygen on spinosad production by saccharopolyspora spinosa. antonie van leeuwenhoek, 2017. 110(5): p. 677-685.

5. 计划与进度安排

1.2019-12-23～2020-03-23：查阅资料撰写开题报告；

2.2019-03-24～2020-04-07：斜面培养基制备与菌种的活化；

3.2020-04-08～2020-06-01：通过代谢工程策略，在刺糖多孢菌中对多杀菌素合成途径中涉及到鼠李糖和福乐糖胺甲基转移酶编码基因spnk和spns构建表达载体，实现过表达。在上述基础上，添加福乐糖胺转移酶编码基因spnp，构建共表达工程菌。对工程菌进行摇瓶发酵，测定发酵产量。