1. 研究目的与意义
背景：中国作为一个农业大国，农药在我国农业生产中具有重大的作用，直接影响到经济和民生的发展。尤其在促进植物的生长、收获、储存和保藏，保鲜和运输加工方面，农药的作用十分显著。目前，在农业生产中普遍使用的农药分为两类，一类是化学农药，另一类则是生物农药。化学农药作为早期防治病虫害的有效工具，长期占据着不可取代的位置。然而，随着时间的推移，人们发现长期使用化学农药后对农作物、生态环境和人体健康都有着不可忽视的危害。各国也日渐明白生态农业中可持续发展非常重要，继而都将目光转投向生物农药，加大了对生物农药的研发和生产。微生物农药由于特异性强，环境危害性小，生产工艺简单的特点而受到人们越来越多的关注。
目的：本实验所研究的多杀菌素(spinosad)是使用较为广泛的一种生物农药。Spinosad是由刺糖多孢菌（Saccharopolysporaspinosa，S. spinosa）产生的一种大环内酯类生物农药（杀虫剂）。其能生产多种多杀菌素结构类似的组分，主要活性成分是组分A (Spinosyn A)和组分D(Spinosyn D)，组分A约占85%，组分D约占15%。具有环境友好、自然分解快、对非靶标动物低毒的特点，广泛应用于蔬菜、棉花、水稻等杀虫和储粮防虫，是迄今发现的最有效和安全的杀虫抗生素。本论文立足于国内外研究现状，以白色放线菌刺糖多孢菌为生产菌，通过基因工程的方法，异源表达来自于波赛链霉菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，提高菌株内的甲基供应水平，增加产量。
意义：多杀菌素作为生物农药，不仅在粮食作物上的残留较少，并且对于生态环境基本不会造成污染。多杀菌素倘若能够进行商业化生产，不仅能使作物产量得到提高，还会对推动经济和社会民生有重要的意义。2. 研究内容和预期目标
具体研究内容如下：
（1）通过代谢工程策略，在刺糖多孢菌中异源表达来自于波赛链霉菌s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，构建表达载体，实现过表达。
（2）对工程菌进行摇瓶发酵，测定发酵产量。
3. 研究的方法与步骤
1）基因组dna的提取。需要试剂和药品：①ez-10柱式细菌基因组 dna 抽提试剂盒②溶菌酶。
2）基因克隆的pcr反应：以波赛链霉菌streptomycespeucetius的全基因组为模板，根据genbank已公布的metk1序列文件，设计一对引物扩增metk1基因。
3）琼脂糖凝胶电泳根据dna分子量大小确定胶浓度，称取对应浓度下的琼脂糖，加入适量1×tae缓冲液，将其煮沸，冷却至60 ℃左右时加入适量na-red染色剂，混匀，倒入制胶板中，待其凝固后放入电泳槽中，用1×tae作为电泳缓冲液，将dna样品与上样缓冲液混合，加入到琼脂糖凝胶的点样孔中，在100 v电压下进行电泳，取出胶板对dna条带进行观察和分析。
4. 参考文献
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5. 计划与进度安排
1）2022-12-23～2022-03-23：查阅资料撰写开题报告；
2）2022-03-24～2022-04-07：斜面培养基制备与菌种的活化；
3）2022-04-08～2022-06-01：通过代谢工程策略，在刺糖多孢菌中异源表达来自于波赛链霉菌s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，构建表达载体，实现过表达。对工程菌进行摇瓶发酵，测定发酵产量。对工程菌进行分批发酵，研究工程菌与野生菌株在发酵性能上的异同。
