人类VASH2蛋白的体外重组构建研究开题报告

1. 研究目的与意义

背景：vasohibin-2（vash2）是近年来新发现的一个基因 ， 属于vasohibin家族 ， 同源于vasohibin-1（vash1），且同源性＞ 50％。vash1是在vegf诱导人脐静脉血管内皮细胞（huvecs）基因表达谱的dna微阵列实验中所发现，受外源性vegf浓度依赖性调节且具有抗血管生成的活性，它普遍表达于人体的各个组织器官，在人的生理病理过程中发挥着重要作用。 与 vash1不同，vash2高表达于骨髓起源的单核细胞中，它不依赖于 vegf 的浓 度调节且具有促进血管生成的作用。

目的：本研究构建了 vash2 慢病毒过表达载体，通过三质粒系统共转染感受态细胞293t，包装产生 病毒后感染人肝癌细胞株hepg2，从而构成稳定高表达vash2的细胞株；同时，利用mtt法和细胞 周期法检测了各组hepg2 的增殖能力。这为进一步研究vash2在肝癌中的功能及作用机制奠定了基础。

意义：本课题组发现，与癌旁组织相比较，vash2高表达于肝癌组织中，虽然具体机制有待进一步研究，但这一 发现对于进一步研究 vash2与肝癌间关系起着重要意义。

2. 研究内容和预期目标

蛋白质酪氨酸化是蛋白质重要的功能调节之一，在细胞周期调控过程中起着重要的作用。本实验主要研究一种血管抑制蛋白（VASH2），该蛋白能与小分子血管抑制结合蛋白（SVBP）相结合，这两个蛋白相互作用后具有微管去酪氨酸活性。进而调节微管的组装与去组装。我们主要通过体外构建该蛋白的重组蛋白，让该蛋白在大肠杆菌中进行表达，进而研究其与其他蛋白的相互作用以及蛋白结构的具体信息，为后续功能性研究或蛋白相互作用研究提供物质基础。

3. 研究的方法与步骤

1.细胞培养：hepg2 和 293t 细胞株用含10％fbs 的 dmem 培养液，于37℃，5％co2 饱和湿度条件下培养。

2.pcr引物设计与合成：用 trizol 试剂提取 hepg2 细胞的总 rna，经逆转录获得 cdna，通过 pcr 扩增获得 vash2目的基因

3.vash2过表达载体的构建：pcr 扩增片段， 反应条件为 95℃ 10 min 预变性，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环，72℃ 10 min。

4. 参考文献

1.和王彦威；vash vash1 1和 和vash vash2 2表达对食管鳞状细胞癌患者预后的影响 表达对食管鳞状细胞癌患者预后的影响，2019，《癌症进展》，23期

2.葛倩倩，涂敏，高文涛等；核型vash2促进人胚胎组织细胞的增殖研究，《南京医科大学学报》，2015年5月

3.iqbal zafar; tawamie hasan; ba weiet.al;loss of function of svbp leads to autosomal recessive intellectualdisability, microcephaly, ataxia, and hypotonia.2019,genetics in medicine :official journal of the american college of medical genetics

5. 计划与进度安排

（1）2022-2022-2学期第1周~第6周，查阅资料，目的基因序列的确定，准备开题报告，外文论文翻译；（2）第7周~第10周（2022-4-6~5-1），选择突变位点，设计引物，合成基因序列等初步设计；（3）第11周~第15周（2022-5-4~6-5），目标基因扩增、剪切、细胞转化、细胞培养、转化子的检测以及重组子等（4）第16周~第18周（2022-6-8~6-26），整理、撰写论文，完成；一张基因扩增电泳检测图、一张质粒酶切电泳检测图，一张重组子构建检测图以及一张蛋白表达电泳图（5）第19周~第20周（2022-6-29~7-10），提交重组子构建的重组细胞、实验报告、英文翻译、图表等，毕业答辩。