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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
细菌在碳源利用选择时，存在葡萄糖效应即当存在葡萄糖和其他碳源时，其他碳源的利用率将会受到限制，其分子机制是利用在转录水平上对非优势碳源利用的相关基因簇进行调控。然而环境中存在的一些芳香烃类污染物由于芳香环的存在往往能够提供细菌充足的碳源和能源，且在这些环境下其他可利用的碳源极其稀少，一些细菌进化出一套负责芳香化合物分解代谢的基因，且这些基因在表达时经常受到调控,表现出葡萄糖效应现象 ref _ref2695793 \r \h \* mergeformat 1，在同时添加葡萄糖和芳香底物时，葡萄糖的利用优先级最高，且芳香化合物的降解基因的转录受到抑制。但是在有机污染物分解代谢领域里又存在着和葡萄糖效应相互矛盾的现象，在只有添加更好被利用的底物时，难降解的有毒污染物才能表现出明显的降解现象，称之为微生物分解代谢难降解污染时的共代谢现象 ref _ref2695828 \r \h \* mergeformat 2，这个现象只是以一种概念的形式提出，并没有相关的分子机制去解释内在原因。
多环芳烃（pahs）极其衍生物作为重要的环境污染物，其生物降解研究受到高度重视，降解基因的挖掘及一些调控基因的验证，1-萘酚是萘的单羟基衍生物，根据过往的毒理学分析，芳香酚类物质随着羟基数量的增加毒性随之增加，一系列动物细胞及动物实验发现萘对于细胞的制毒机制是由萘的羟基化代谢产物及羟基化后氧化生成的醌类物质决定的 ref _ref2695850 \r \h \* mergeformat 4。总之萘酚作为一种重要的环境毒物，其微生物降解的研究只有少数报道。
印度科研人员在假单胞菌c5pp中鉴定了整套1-萘酚降解的基因簇，1-萘酚经过第一步羟化反应生成1,2-二羟基萘，随后一系列的双加氧，异构，醛缩及脱氢反应转化为水杨酸，水杨酸作为重要的中间产物随后经由龙胆酸步骤开环进入三羧酸循环实现细菌的供能 ref _ref2695871 \r \h \* mergeformat 3。但是整个过程中并不存在任何调控现象的发生。本实验室在早期分离获得的菌株b2能够降解敌草胺生成1-萘酚，但是1-萘酚随后的降解速度非常缓慢，在基础盐培养基积累达到很高的浓度，但是添加容易利用的碳源如葡萄糖时却能够显著增强菌株b2对于萘酚的降解速度。之后进行转录组实验，鉴定出菌株b2中代谢1-萘酚的整套基因，同样首先通过ndca1a2的负责的羟化反应生成1,2-二羟基萘，随后1,2-二羟基萘通过水杨酸被矿化生成co2和h2o。进一步确定了第一步反应为整个降解过程的限速步骤，分析负责第一步反应的基因ndca1a2的上下游基因，发现两个可能参与转录调控的分别属于lysr家族和iclr家族的转录调控蛋白。我们推测这两个调控蛋白可能响应葡萄糖的代谢从而实现对ndca1a2的转录调控。并且初步探究细菌采用这种调控机制的可能原因，进一步以1-萘酚的降解作为模型探究共代谢的分子机制（尝试从底物，产物毒性差异角度挖掘）。
2. 研究的基本内容和问题
有机污染物萘酚是一种高毒性pops（持久有机污染物），在环境中半衰期较长。由于工业的快速发展及污染物的大量排放，萘酚被释放到环境中，对土壤水源造成较大的污染。现在虽然利用光催化、酸碱反应可以使萘酚得到一定的消除，但利用微生物降解萘酚仍是一种重要途径。
本实验室前期分离获得一株萘酚降解菌sphingobium sp. strain b2，其代谢途径及相关基因已得到初步揭示。在该菌株中萘酚首先被萘酚单加氧酶ndca1a2转化为1,2-二羟基萘。该酶属于nadh、fad依赖性单加氧酶。1,2-二羟基萘进一步通过中间产物水杨酸进入三羧酸循环实现矿化过程，而细菌能从该降解过程中获取碳源。然而，该细菌在添加萘酚作为底物的基础盐培养基（msm）中利用萘酚的速率非常缓慢（3d），但添加葡萄糖后降解速率得到了显著提升。通过ndca1a2的同属菌株异源表达实验，发现萘酚的转化速率较其在原宿主内快。据此推测，在菌株b2中ndca1a2的表达存在转录水平调控现象。
细菌中，转录水平的调控主要依赖于转录调控蛋白，如tetr、iclr、lysr 等家族。我们依据b2菌株的全基因组测序结果，推测位于ndca1a2上游的分属lysr和iclr家族的转录调控蛋白可能参与了该现象的调控。实验室将这两个蛋白分别命名为ndcs和ndcr。通过查阅相关文献，发现ndcs所属的lysr家族主要发挥转录激活作用，ndcr所属iclr家族发挥转录阻遏作用。我们认为该调控可能存在ndcs和ndcr的交联互作现象。
3. 研究的方法与方案
1.基因敲除回补确定ndcs和ndcr在调控萘酚降解中的作用
2.确定pndc功能
3.emsa和dnase1足谱印记确认两个调控蛋白与pndc结合情况及结合位点
4. 研究创新点
在细菌的碳源利用转录调控操纵子模型中，往往存在葡萄糖效应，即优先级碳源的利用，然而菌株B2在代谢利用芳香化合物萘酚作为碳源时却存在相反于葡萄糖效应的现象，当添加更容易被利用的碳源如葡萄糖时，菌株B2代谢萘酚的速度会大大加快。本实验将通过分析萘酚降解通路及各个反应步骤的速率得到萘酚降解的第一步为限速步骤，由限速酶NdcA1A2负责将萘酚转化为1,2-二羟基萘，并且进一步探究了ndcA1A2在转录水平上受上游两个转录调控蛋白NdcS和NdcR调控，体外和体内实验确定两者在调控时呈相互拮抗关系。由ndcS和ndcR的基因敲除，基因回补得到两个蛋白的在调控时的具体交互作用。
5. 研究计划与进展
（1）分析菌株降解萘酚过程中的限速步骤；
（2）确定pndc的功能；
（3）分别敲出ndcs、ndcr观察菌株表型（萘酚降解速率），确定两者在萘酚降解中扮演的角色（转录激活或转录阻遏）；
