1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
近年来，由于现代工业的发展、工业废水排放的日益增加、农业中含cd农药的大量使用等，已使我国土壤cd污染状况日益严重,并直接危害农作物生长。cd污染是当今重金属污染中面积最广、危害最大的重金属元素之一,被称为"五毒之首，土壤中cd含量的上升不仅会降低植物，尤其是农作物的生产力，同时还会通过食物链影响人类身体健康，并被美国管理委员会(atsdr)列为第6位危害人体健康的有毒物质，对cd污染的研究一直是当前学术界的热点研究课题。紫花苜蓿，苜蓿属，多年生草本，是世界上广泛种植的饲料与牧草。传统的育种方式对其产量及品质的改良幅度多年来徘徊不前，已经远远不能满足生产需要，对于品种的改良，极大的依赖于基因的克隆与改良。
目前，关于植物对cd的吸收、转运及解毒机制的研究取得了很大进展，为进一步应对农作物重金属污染奠定了理论基础。植物体内cd的解毒机理一般为：减少吸收；富集后储存于表皮毛；利用金属硫蛋白（mt）或植物络合素（pc）使之螯合或形成沉淀；抗氧化防御系统清除起伤害作用的自由基；利用一些转运体（如nramp等）将吸收的cd再转运出去。目前发现，紫花苜蓿中存在的nramp基因可以编码影响植物体内cd运输的蛋白质，本课题通过对该基因的克隆与过表达载体的构建，可以进一步明确植物对cd胁迫的响应方式，进一步缓解cd对植物影响。
nramp，即naturalresistance-associatedmacrophageprotein，自然药代动力学巨噬细胞蛋白质是进化中保存下来的二价金属转运蛋白。nramp基因家族首先是在动物中发现并克隆的，1991年首次在小鼠中发现nramp基因家族，并相继鉴定了人体内的3个nramp基因。水稻中存在至少3个以上的osnranp基因；而在拟南芥中则存在6个atnramp基因，1、2、6号定位于1号染色体上，atnramp3、atnramp5、atnramp4分别定位于2号、4号和5号染色体上。
2. 研究的基本内容和问题
（1）目标：对紫花苜蓿的nramp6基因进行克隆，以及构建相应的过表达载体，从而进一步验证nramp6基因的功能，以及其在紫花苜蓿应对cd胁迫中所起到的作用，为下一步研究耐cd植物提供一条新的思路与方法。
（2）内容：本课题旨在从维多利亚苜蓿叶片中克隆出nramp6基因，测序比对成功后，通过农杆菌介导转入拟南芥幼苗进行过表达载体的构建，从而对该基因的功能进行更深层次的研究。
（3）拟解决的关键问题：
3. 研究的方法与方案
（1）技术路线及实验方案：
（a）苜蓿的种植与cd处理
（b）苜蓿根部总rna的提取与cdna的合成
4. 研究创新点
（1）引物设计是根据，已成功测序的蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）的NRAMP6基因的基因序列，应用于亲缘关系较近的紫花苜蓿维多利亚型（MedicagoSativa,cv.Victoria）苜蓿中。
（2）利用过表达的突变植株与正常状态的野生植株进行对照，明确MsNRAMP6基因的在Cd运输中的确切功能。
5. 研究计划与进展
（1）2014年7月，阅读相关文献资料，确定研究课题与实验方案，制定详细的计划。
（2）2014年9~10月中旬，苜蓿nramp6基因的克隆与测序。
（3）2014年10~2015年1月，过表达与载体的构建，并收取种子。
