抗草甘膦转基因大豆与吉林白城野生大豆F3代在两种土壤下的适合度开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

从美国孟山都公司于1994年成功研制出第一代抗草甘膦转基因大豆gts 40-32（401-3-2），到2018年，全球已有28个抗除草剂转基因大豆转化事件^[1]。由于抗除草剂转基因大豆的杂草防除简便灵活，成本低受到种植者的青睐。从1996年商业化以来，种植面积不断扩大，到2018年转基因大豆的种植面积已占转基因作物种植面积的50 %，且全部都具有抗除草剂性状。

大豆（glycine max (linn.) merr.）作为国民生活中必不可少的经济作物之一，在我国已有5000多年的栽培历史。但是自1996年世界上第一例转基因大豆开始商业化种植以来，我国大豆的进口量逐年递增，到2019年已达8851万吨，较1996年增长了20倍^[2]。其中转基因大豆占全部进口大豆的98%^[3]。因此培育有自主知识产权的转基因大豆是我国科学家不断努力的目标。陆续发掘出一系列抗除草剂的基因，包括可用于大豆的抗草甘膦基因epsps^[4]、g10-epsps^[5]和g2-aroa^[6]；此外，利用融合基因的方法，发明了草甘膦和草丁膦复合抗性的融合蛋白基因^[1]。还培育出有商业化的抗除草剂的转基因大豆，如南昌大学研发的抗草甘膦转epsps基因大豆rr1^[7]和上海交通大学研发的拥有独特dna分子的耐草甘膦除草剂大豆shzd32-01^[8]。因此在此背景下，商业化种植抗除草剂转基因大豆势在必行。

在任何转基因作物商业化之前，都应对其生态安全性进行全面评价，包括作物自身杂草化的风险。就目前已有的报道来看，转基因大豆自身杂草化的风险极低。宋小玲等以抗除草剂转基因大豆品种抗农达大豆40-3-2、非转基因受体大豆品种a5547-127和南京常规大豆品种n2899为材料，进行大豆的杂草性评估实验，通过比较落粒数评估落粒性，比较收获大豆种子的发芽数和腐烂数评估延续能力，发现三种大豆的繁育能力较弱，不符合杂草种子的适应性^[9]。李昊阳等利用转g10-epsps基因抗草甘膦大豆shzd32-01、转化体的受体材料中豆32和黄淮海地区主栽品种皖豆28为材料，分析大豆及杂草群落的生长，发现在常规种植条件下，三种大豆的种植区域内杂草发生情况无显著差异；而在非适宜季节，三种大豆的繁育系数没有显著差异，经过比较得出结论，转基因大豆没有杂草化的风险^[10]。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究的目标

本实验以南京农业大学大豆改良中心自主研发的抗草甘膦转基因大豆t14r 1251-70和吉林白城野生大豆杂交f3代为材料，比较转基因大豆、野生大豆及其f3代的营养生长指标，分别是出苗率、主茎长、子叶真叶大小、地上部干生物量，生殖生长指标，分别是花器大小、单株结荚数、单株荚重、单株饱粒数、单株饱粒重、荚大小、百粒重。通过这些指标分析比较杂交后代与亲本的适合度差异，以此来评估抗草甘膦转基因大豆向野生大豆基因漂移的生态风险。

2.研究内容

3. 研究的方法与方案

1. 研究方法与实验方案

   以直径7cm，高7.5cm，底部打孔的一次性塑料杯为播种容器，每杯播种1粒种子，其中抗草甘膦转基因大豆和吉林白城野生大豆的播种数量为150粒，F3的播种数量为250粒，待杯中植株的第一个三出复叶未完全展开时，对F3代植株进行分子筛选，将鉴定出含EPSPS基因的植株进行移苗，每个单株移入底部有孔的塑料花盆中，所用土壤分别采用农田土和荒地土，然后统一进行正常的田间管理。

   2.1杂交F3代植株携带抗性基因的检测

   提取供试材料总DNA，抗草甘膦转基因大豆为阳性对照，以吉林白城野生大豆（JLBC）为阴性对照，采用PCR检测，通过琼脂糖凝胶电泳检测测定抗草甘膦转基因大豆与野生大豆杂交F3代是否携带EPSPS基因。

   2.2 抗草甘膦转基因大豆T14R 1251-70、吉林白城野生大豆（JLBC）及两者的杂交F3代营养生长指标的比较研究

   在三种大豆出苗完成后，统计大豆的出苗率。大豆第一对复叶未展开时，测量子叶真叶大小。第三个三出复叶完全展开时，测量主茎长。收获期，称量所有样本的地上部干生物量。

   2.3抗草甘膦转基因大豆T14R 1251-70、吉林白城野生大豆（JLBC）及两者的杂交F3代生殖生长指标的比较研究

   在盛花期测量花器大小，完熟期测量荚大小并统计单株结荚数，收获期统计单株荚重、单株饱粒数、单株饱粒重、荚大小、百粒重。

   表1 适合度调查指标

各指标统计和测量方法：

1. 生育期：分为出苗期、分支期、现蕾期、初花期、盛花期、结荚期、成熟期。

2. 出苗率：统计播种材料苗期所有出土幼苗数，出苗率=出苗数/播种种子数×100%。

3. 子叶真叶大小：第一片复叶未展开时期，利用游标卡尺测量子叶的长度宽度、真叶的长度宽度。

4. 主茎长:第三个三出复叶期利用直尺测量植株顶端到地面的高度

5. 花器大小:在植株盛花期，随机选取单株上完全盛开的花蕾，测量萼片长度、翼瓣长度、龙骨瓣长度、花瓣外露长度、沟槽长度。

   萼片长度：花瓣裂口正对着的萼片，其顶部到基部的长度；

   翼瓣长度：翼瓣顶部到花托的长度；

   龙骨瓣长度：龙骨瓣顶端到花托的长度；

   花瓣外露长度：旗瓣顶端到花托的长度-萼片长度；

   沟槽长度：花瓣裂口正对着的萼片，其顶端到萼裂片V形底端长度。

6. 荚大小：每个单株均随机选取20个荚，测定每个荚长、宽、厚。

7. 单株结荚数：植株单株结荚的总数量。

8. 单株荚重：植株单株荚皮的总重量。

9. 单株饱粒数：植株单株饱粒的总数量。

10. 单株饱粒重：植株单株饱粒的总重量。

11. 百粒重：100粒种子的重量。

12. 地上部干生物量：将收获的单株地上部晒干，称其重量。

1. （1）本实验指导老师宋小玲教授多年来带领团队致力于研究抗除草剂转基因作物的抗性基因漂移和后代适合度，在转基因作物的生态安全评估方面有着丰富的经验和成果。

   （2）本实验是国家转基因重大专项“抗草甘膦转基因大豆向野生大豆的基因漂移及抗性杂草的监测控制技术”的一部分，拥有经费支持。

   （3）导师所带领的团队已经通过多年的实验熟练掌握了适合度指标的测定、田间管理方法等，为本次实验的进行奠定了坚实的基础并提供了实验材料即抗草甘膦转基因大豆、吉林白城野生大豆和两者杂交F2代的种子（F3）。

   （4）本实验室配备有实验所需的材料和工具，例如一次性纸杯、塑料花盆、游标卡尺、显微镜、称量天平等，实验室还提供了PCR检测所需要的条件，为实验的进行提供物质保障。

4. 研究创新点

1. 前人关于抗草甘膦转基因大豆的研究多集中与基因漂移的频率和距离，本实验重点关注抗草甘膦转基因大豆与野生大豆杂交F3代的适合度。

2. 本实验使用农田土和荒地土两种土壤条件，模拟不同生境（农田和野外）下抗草甘膦转基因大豆与野生大豆杂交后代材料的生长条件，充分评价抗草甘膦转基因大豆与野生大豆杂交后代的适合度效应。

5. 研究计划与进展

2019年05月-2019年06 月：试验材料的前期准备；播种抗草甘膦转基因大豆、吉林白城野生大豆及两者杂交f3代；携带抗性基因f3代的鉴定。

2019年06月-2019年07月：各营养指标：出苗率、子叶真叶大小、主茎长的测量。

2019年08月-2019年10月：各生殖指标：花器大小、荚大小生殖指标的测量。