1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
一、课题背景
蚕豆蚕豆(faba bean)，学名vicia fabal.，植物学分类上属于豆科（leguminosae），蝶形花亚科（papilionoideae），巢菜属(vicia l.)，别名南豆、胡豆等，北方也称其为大豆，为异花授粉的一年生或越年生二倍体草本植物，是一种优良的粮、菜、肥间用作物[1]。蚕豆是由西汉张骞自西域引入中原地区，在我国主要以长江以南为主。蚕豆是世界上第三大重要的冬季食用豆作物，其营养价值较高，富含蛋白质、糖、矿物质、维他命、钙和铁。此外，蚕豆隶属于小杂粮，既可作为传统食物，又是现代绿色食品和营养保健食品。是富含营养及蛋白质的粮食作物和动物饲料。为了提高蚕豆的产量和经济效益，人工春化技术已经广泛应用于我国的蚕豆种植当中。但是目前的研究当中，关于蚕豆春化的相关基因还不明确，因此，我们对蚕豆春化相关基因展开相应的工作。
1春化作用研究进展
春化作用(vernalization)一般是指植物必须经历一段时间的持续低温才能由营养生长阶段转入生殖阶段生长的现象，即低温诱导植物开花，其存在于大多数开花植物之中，具有重大的农业实践意义，故而多年来广受关注。高等植物的开花过程极为复杂，春化是其中的一个途径之一。植物感受春化作用部位是有丝分裂旺盛茎尖生长点，而完成春化的植株不仅可以将这种刺激保持到开花，还可以将其传递到各级分蘖的组织。春化结束后，植物的内部生理代谢发生变化，包括呼吸速率、核酸、蛋白质含量以及植物激素水平等。已有研究表明，春化作用相关基因在拟南芥和小麦等作物中研究比较明确，其中拟南芥开花时间由五个主要途径（自主，春化，光周期，衰老和赤霉素途径）和非编码rna控制，其中春化途径是通过控制floweringlocus c（flc）的活性来控制植物开花。拟南芥春化作用机理如图1，花通路整合因子花位点t（ft）和过表达co1（soc1）作为flc的抑制因子，通过沉默flc来促进开花。此外，春化作用通过vrn2和lncrna介导的表观遗传调控抑制flc的表达，促进植物开花。而vrn2在植物体内的浓度受到vrn1和vrn3的相互作用[2]。
2. 研究的基本内容和问题
一、研究的目的及意义
中国是世界蚕豆的主要出口国和生产国，传统的蚕豆生长期比较长，一般是从次年11月份开始，持续到来年5月。人工春化能够明显的缩短蚕豆的生长期，提高蚕豆的经济效益与价值。同时能够增加农民的收入，提高国民生产总值。在我国蚕豆春化的研究才刚刚起步，多数研究都在生理方面，人工春化能够明显加速蚕豆开花结果的过程，但是在与春化基因相关的研究还有所不足。因此，本实验旨在完善蚕豆春化的理论机制，对蚕豆春化作用相关基因VfSOC1，VfADO3、VfGI作用机制展开研究，为蚕豆的栽培、种植等方面提供参考研究。
3. 研究的方法与方案
| 一、蚕豆基因的克隆、表达与分析 本试验克隆了蚕豆的 VfSOC1，VfADO3、VfGI，并对其进行了生物信息学以及不同组织和不同处理的表达分析 1材料与方法 1.1.植物材料 本实验蚕豆，由江苏省农科院经济作物研究所提供。 1.2.菌株及质粒 大肠杆菌(Escherichia coli) DH5a、农杆菌（Agrobacterium Strain）GV3101、中间载体 pClone007 （由擎科生物公司提供）和终载体 pWM101 均由本实验室留存。 1.3.试剂 植物总 RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒；高保真酶购于南京诺唯赞有限公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒； 1.4.试验仪器 离心机（赛默飞）、凝胶成像仪、超净工作台（苏净）、台式冷冻恒温振荡器 （THZ-C-1）、水浴锅、高压灭菌锅（GI80TR）、PCR 扩增仪（东胜）、电泳槽、荧光定量 PCR 仪（LightCycler 480 System）等。 1.5.Vf SOC1、VfADO3、VfGI的克隆及载体的构建 根据蚕豆春化转录组数据分析获取差异表达的基因序列，利用软件分析基因的CDS区域并与拟南芥同源序列对比，确认CDS区序列（编码蛋白产物的序列），并设计引物； 1.5.1.以蚕豆的cDNA为模板，进行PCR 扩增。离心混合均匀反应体系中的各成分，并将其置于 PCR 仪之中，进行 PCR 反应：反应条件与体系如下表：普通taq酶扩增及反应 表3-1普通taq酶扩增反应体系
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| 表3-2普通taq酶扩增反应程序
1.5.2.高保真酶扩增 表3-3 高保真酶扩增反应体系
表3-4 高保真酶扩增反应程序
1.5.3.凝胶回收
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| 将 PCR 产物DNA凝胶电泳鉴定，并对其进行凝胶回收，其步骤如下： 1)切胶后向胶块中加入溶解buffer MB 每100mg加入3-5倍体积的Buffer MB 2)37℃溶解胶块5-10min，加热溶解，每隔2min取出离心管颠倒混匀，使胶块充分溶解，溶解完成后，静止至室温，此时溶液应该为黄色 3)将上述溶液转移到DNA fragment mini column 中，室温静止1min后，室温12,000rpm离心1min，弃废液。 4)向DNA柱中加入750μl的Buffer WB ,室温12，000rpm离心1min，弃废液。（Buffer WB已加入指定体积的100%乙醇），重复一次。 5)12,000rpm离心2min空转 6)将DNA柱放到新的1.5ml的离心管上，在DNA柱膜中间加入50μl65℃无菌水，室温静置1min。 7)室温12,000rpm离心2min，洗脱DNA。 1.5.4.目的基因连接克隆载体 PCR 产物回收与 pclone007连接，连接体系与反应如下： 表3-5反应体系（10μl）
加入后用移液器吹打混匀 反应条件：25℃ 5min 表3-6插入片段推荐用量
转化： 1)取50μl冰融的感受态细胞（DH5α）,加入目的反应产物，轻轻混匀，冰上静止25min； 2)42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴中，静置2min。切勿晃动
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| 3)向离心管中加入500μl不含抗生素的无菌培养液（LB）,混匀后37℃摇床200rpm复苏1h。 4)将复苏的菌液5000离心1min，将上清吸取200-300μl丢去，吹吸混匀后涂布到无菌的LB固体培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜。 1.5.5.菌落PCR 1)每个处理取8个1.5ml无菌离心管，各加入20μlddH2O，1μl的移液器取菌斑于各离心管中； 2)每个处理另去八个PCR管，进行菌落PCR，反应体系与反应程序如下： 表3-7菌落PCR反应体系
表3-8菌落PCR反应程序
3)每个离心管加入400μl100mM氨苄-LB液体培养基,37℃，200rpm复苏4-5h，直到菌液浑浊（阳性克隆质粒）。 4)将阳性克隆质粒一半4℃保存，一半送至擎科生物公司测序，测序分析是否为真实序列。 1.5.6.Vf SOC1、VfADO3、VfGI生物信息学分析 应用 NCBI 网站翻译从 NCBI 数据库中检索不同物种SOC1、VfADO3、VfGI基因的 cDNA 序列，下载相似度大于 80％的序列。利用 DANMAN 8.0 软件比对蛋白质序列，并使用MEGA7.0 构建系统发育树。
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| 1.5.7.Vf SOC1、VfADO3、VfGI基因表达分析 1)取样：将蚕豆在 4℃的温度下对植物进行0d、12d的春化处理，然后移栽温室培养10d。此后取分别各组叶片100mg即用液氮冷冻，并在-80℃下保存。每组样品采取三个重复。 2)引物设计：利用软件设计Vf SOC1、VfADO3、VfGI的 qPCR 引物
表3-9荧光定量 PCR 反应体系
表3-10荧光定量 PCR 反应程序
表3-11溶解曲线分析
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三、可行性分析 本实验研究的基因在其他生物如拟南芥、小麦等模式生物已经研究的比较全面，其所涉及的分子生物学实验（包括反转录、PCR、qPCR等）、微生物相关实验（平板培养、微生物培养技术）和生物信息学分析等皆可以进行，所涉及的试剂由江苏省农科院经济作物所购买提供，实验经费充足，实验条件符合标准。
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4. 研究创新点
一、创新之处
1.本研究在春化处理的蚕豆中，克隆了蚕豆的Vf SOC1、VfADO3、VfGI基因，并对其进行生物信息学分析。
2.本研究在大量阅读相关文献的基础上，极大的缩短了研究所需要的时间
5. 研究计划与进展
七、研究计划
1.2019年1月1日-2019年1月18日完成对vf soc1、vfado3、vfgi三种基因的克隆
2.2019年1月1日-2020年2月14日完成野生型拟南芥到花期的培育
