厌氧真菌木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

半纤维素广泛存在于植物中，是植物细胞壁的主要组成成分，大约占了植物干重的15%～35%，在自然界中是含量仅次于纤维素的多糖^[1]。与纤维素相比，半纤维素的组成成分更为复杂，它包括了木聚糖、葡萄糖甘露聚糖、阿拉伯木聚糖、木葡聚糖、半乳葡萄甘露聚糖等多种组分^[2]。木聚糖是其中占比最大，也是最复杂的多糖类物质，由于其结构原因，大部分的木聚糖在自然界中很难被利用^[3]。木聚糖酶是一种可以将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的多组分复合酶系，如今木聚糖酶在饲料工业、制浆造纸、食品等多方面展现出了良好的应用前景。本研究旨在将厌氧真菌木聚糖酶的基因克隆到大肠杆菌表达系统中表达，经过转化得到重组蛋白并对得到的重组木聚糖酶进行相关的酶学性质研究。

大肠杆菌作为宿主菌的原核表达系统是研究最早也是最为广泛的表达系统，该表达系统有着遗传背景清楚，载体受体系统完备，培养简单，生长周期短等优势。因此越来越多的科学家从不同菌体中获得木聚糖酶，并将来源不同的木聚糖酶基因以大肠杆菌为宿主实现表达。2016年何瑶，殷欣，吴芹^[4]等人人工合成了 11家族耐热木聚糖酶基因xynll^em并将其克隆至表达质粒 pet-28a( )中，获得重组质粒pet-28a-xynll^em。随后转化escherichia coli bl21(de3)，成功构建了可以表达耐热木聚糖酶的基因工程重组菌e.coli bl21/xynll^em，实验结果表明xynl l ^em成功在e. coli bl21中实现了异源表达，耐热木聚糖酶良好的热稳定性具有较好的工业应用潜力。同年吴迪^[5]将来源于短小芽抱杆菌 nj-m2的木聚糖酶基因与绿色荧光蛋白基因(gfp)进行融合表达，成功将木聚糖酶展示在大肠杆菌细胞表面，从而得到了一种能将木聚糖酶展示表达在细胞表面的大肠杆菌菌株。这一研究为木聚糖酶的工业固定化和发酵应用提供了理论依据。

参考文献：

2. 研究的基本内容和问题

1.1项目研究目标

本研究旨在将瘤胃厌氧真菌木聚糖酶的基因克隆到大肠杆菌表达载pet-28a中，通过双酶切鉴定筛选阳性重组子，然后将阳性质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)中得到重组工程菌，经过培养和iptg诱导后表达重组蛋白，进行sds-page电泳检测，并对重组木聚糖酶进行相应的酶学性质研究，包括最适温度，温度的稳定性，最适ph以及ph稳定性，使用dns法测其酶活，并测出所得酶液的蛋白浓度，计算其比酶活。

1.2项目研究的内容

3. 研究的方法与方案

1.1 4种木聚糖酶基因的克隆及测序

利用切胶回收试剂盒分别切胶回收四个目的基因片段，并与pucm-tvector连接，阳性克隆送往公司测序。

1.2 重组表达质粒的构建

4. 研究创新点

利用DNS法测定木聚糖酶的酶活是最简便、最常用的方法。

选择遗传背景清楚、操作手段成熟的大肠杆菌表达系统，有着大肠杆菌繁殖快、营养要求低、表达的外源蛋白稳定、易纯化等特点，有利于木聚糖酶性质的研究。

5. 研究计划与进展

第一阶段（2018.12—2019.1）学习并掌握酶活测定的基本流程和方法

第二阶段（2019.2—2019.3）完成四株木聚糖酶最适温度、最适ph的测定

第三阶段（2019.3—2019.4）完成四株木聚糖酶的蛋白分子量测定，蛋白浓度测定，计算其比酶活