1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1 研究意义
纤维素类物质是地球上分布最广、含量最丰富的碳源物质，对人类而言，它是自然界中数量最大的可再生资源。地球每年都会产生大量的植物纤维素，但其中只有很少一部分得到利用，造成极大的资源浪费和环境污染。随着现代资源的开发利用，纤维素资源越来越受到重视，被大量用于纺织业、造纸业、食品工业以及饲料工业中。纤维素资源被利用的过程需要添加外源纤维素酶对其进行降解。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，其对纤维素的转化利用对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。虽然许多微生物都能合成纤维素酶，但产酶效率普遍较低，产酶能力和各种酶组分差异很大，质量不稳定，成为制约其在生物加工过程中广泛应用的瓶颈[1]。高效率、低成本生产实用纤维素酶已成为研究开发的热点和难点[2]。反刍动物瘤胃中栖息着大量的能分泌纤维素酶的厌氧微生物，使得瘤胃具有较强的发酵和分解纤维素的能力，因此研究反刍动物瘤胃厌氧真菌纤维素酶，有望构建成高效降解纤维素的纤维素酶重组工程菌，对实现纤维素酶的大规模生产和应用有着重要意义。
2 国内外研究进展
2. 研究的基本内容和问题
| 1 研究目标 采用大肠杆菌原核表达系统对来源于瘤胃厌氧真菌的纤维素酶重组表达，并进行酶学性质分析，为该酶的后续研究工作奠定基础，并为研究开发高效率、低成本实用纤维素酶提供依据。 2 研究内容 （1） 厌氧真菌纤维素酶的克隆表达 |
筛选两种厌氧真菌纤维素酶基因序列，选择大肠杆菌克隆载体（pUC57）及其菌株E.coli DH5α、表达载体（pET-28a）及其菌株E.coli BL21（DE3）、酶切位点（Ndel/Xhol），交由上海生物工程有限公司构建重组工程菌。
| （2） 纤维素酶SDS-PAGE胶鉴定 |
对重组工程菌进行培养，诱导表达目的蛋白，制取粗酶液进行SDS-PAGE检测。
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厌氧真菌纤维素酶学性质研究
| 对重组工程菌进行培养，诱导表达目的蛋白，制取粗酶液进行酶学性质检测，包括比酶活测定、最适温度测定及最适pH测定。 3 拟解决的关键问题 获得厌氧真菌纤维素酶的大肠杆菌表达菌株，并研究其酶学特性，旨在为之后研究开发高效率、低成本的实用纤维素酶奠定基础。 |
3. 研究的方法与方案
1 研究方法及实验方案
1.1厌氧真菌纤维素酶的克隆表达
（1）重组表达载体的构建
筛选两种厌氧真菌纤维素酶基因序列，将基因片段和质粒pUC57用Ndel和Xhol双酶切，胶回收并纯化，经T4 DNA连接酶连接后转化大肠杆菌(E.coli)DH5a感受态细胞，LB平板上筛选重组子。提取质粒、酶切，菌落PCR和测序鉴定，得到重组表达质粒。
（2）纤维素酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达
将重组表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，挑选重组子，提取质粒、酶切，菌落PCR和测序鉴定，得到重组工程菌。
1.2纤维素酶SDS-PAGE胶鉴定
（1）制备粗酶液
①将保存菌株在含50μg/ml的卡那霉素LB固体平板划线培养16~24 h，挑取单菌落于50μg/ml的卡那霉素LB 5ml液体培养基过夜培养；
②按照1%接种量，将菌株在500ml含同抗生素浓度的培养基中扩大培养3~4h，待OD600=0.4~0.6时加入500μl浓度为0.5mM/ml IPTG 使IPTG终浓度为0.5mM/l。诱导4h。
③将菌液用真空泵抽真空，将菌泥从滤纸上刮下来置于5ml的离心管中，加入3ml的TE缓冲液（最适pH时要换缓冲液），用振荡器充分震荡使其均匀。
④使用超声波破碎仪冰上破碎，功率输出35%，10S on/10S off，循环5次间歇1min，再循环5次，防止温度过高，烧焦蛋白质。
⑤将超声破碎后的菌液置于离心机中12000r离心30min，取上清即为粗酶液。
（2）SDS-PAGE
①制胶：配制分离胶和浓缩胶。
⑥电泳：将凝胶架取出来，放在电泳槽，加入电泳缓冲液，上槽加电泳液的体积要接近长板，没过样品位置，下槽中电泳液的位置大约在1/3左右。
②加样：取粗酶液10ul，混合10ul上样loading buffer。
③电泳：一开始低电压利80v(8v/cm)于蛋白质在同一起跑线上,位置在分离胶前沿一条窄带，后面120v(12v/cm),电泳1.5~3h,直至溴酚蓝试剂迁移到凝胶底部时，停止电泳。
④剥离胶：把电泳槽取出，拿下来胶板，用刮片从长短玻片中间翘起，把浓缩胶刮掉，取下。
⑤染色：把考马斯亮蓝R250溶液倒入平板染色20 min~1h，转速45rpm/min
⑥脱色：转速45rpm/min，加入脱色液4~8 h，用脱色液脱色3~4次。
（3）进行图像采集与分析
1.3厌氧真菌纤维素酶学性质研究
（1）比酶活测定
| 以羧甲基纤维素钠（CMC）为底物，采用DNS法测酶活。采用Bradford法测定粗酶液蛋白浓度。由测定的酶活与蛋白浓度计算酶的比酶活。 |
①DNS法测定酶活
1个酶活定义单位（U）定义为在规定反应条件下，每分钟释放出1umol产物的酶量。
制备粗酶液,精确吸取待测稀释酶液100μl （每个样品3支平行试管），置于40℃水浴预热2min，加入同样经预热的用pH 5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制的 1％羧甲基纤维素钠溶液300μl,立即计时，于40℃水浴精确反应15min，迅速加入DNS液600μl终止反应，然后在沸水浴中沸腾5min，取出后用流水冷却，摇匀。同时作空白对照，在待测稀释酶液100μl中先加入DNS试剂600μl使酶失活，然后加入0.5％羧甲基纤维素钠溶液300μl，同样置40℃水浴15 min。在波长540 nm处用酶标仪测定光度值。
②蛋白浓度测定：用Bradford试剂盒测定粗酶液的蛋白浓度。
（2）最适温度
20~80℃，间隔10℃设置温度梯度（pH 5.0）。将底物和酶在设定温度下水浴1min，确定达到实验温度。底物与酶在设定温度40℃下反应15 min测定酶活。以酶活最大值为100%计算其他温度的相对酶活。
（3）最适pH
设置pH梯度为3、4、5、6、7、8。底物与酶在设定pH下反应15 min测定酶活。以酶活最大值为100%计算其他pH的相对酶活。
2 技术路线
3 可行性分析
| （1）查阅了大量的相关的技术资料，设计了合理的技术方案和路线，初步建立了相关的试验方法和检测手段。 （2）本试验将在南京农业大学消化道微生物实验室开展，该实验室仪器设备先进齐全，技术力量强，并将在成艳芬教授的指导下完成，具备了进行本课题研究的基本条件。 |
4. 研究创新点
| 特色或创新之处 对厌氧真菌纤维素酶在大肠杆菌原核表达系统中表达，为研究开发高效率、低成本实用纤维素酶提供依据。 |
5. 研究计划与进展
| 研究计划及预期进展 2018.9-2018.11 查阅相关文献资料，筛选厌氧真菌纤维素酶基因序列；确定大肠杆菌克隆载体及菌株、表达载体及菌株、酶切位点，交由上海生物工程公司构建重组工程菌。 2018.11-2018.12 完成目的蛋白SDS-PAGE鉴定； 2019.2-2019.3 完成重组工程菌纤维素酶活性测定和酶学性质研究。 2019.4-2019.5 统计分析试验数据、撰写毕业论文。 |
