1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
病毒样颗粒（virus-like particles ,vlps）是一种相对稳定的空病毒衣壳,其颗粒内部没有病毒本身的dna 或rna。许多病毒的结构蛋白亚基都具有自我组装成病毒样颗粒的能力。病毒样颗粒在形态结构和抗原性上都与天然的病毒颗粒相似，并且可以通过基因工程的方法使vlp的表面附带其他抗原分子。通常 vlp具有很强的免疫源性和生物学活性，它能够引起强烈的体液免疫反应和细胞免疫反应[1]。
病毒样颗粒qβ是属于光滑病毒科的一种rna噬菌体，其颗粒是由180个衣壳蛋白组装形成的二十面体，衣壳蛋白（coat protein，cp）的基因的c-末端能够融合其他蛋白序列[2][3][4]，表达后的融合蛋白能够形成嵌合体颗粒，这也使得rna 噬菌体 qβ被认为是非常有应用潜力的vlp。已有报道过通过化学偶联方式以及融合蛋白表达方式对 qβ进行改造并利用其进行免疫学研究，如bachmann mf. 等人曾在 qβ颗粒表面偶联烟碱（nicotine）做成 nicotine-qβ vlp [5]以及将 cpg dna包裹进入qβ的内部[6]。m.g.finn等[7]在编码qβ衣壳蛋白的c-末端融合表达表皮细胞生长因子（epidermal growth factor， egf）获得嵌合的vlp以及插入表达igg结合的z结构域获得嵌合qβ病毒样颗粒[8]。
由于现代疫苗多为重组疫苗，其在宿主体内不进行复制，但是当病毒和其他病原分离的可溶性组分在缺乏非特异性炎症刺激时免疫原性非常弱 [9][10][11][12]。因此，重组疫苗需要用佐剂的帮助来增强疫苗的免疫原性。然而，有效的佐剂没有很好的耐受性，并且其中只有非常少的佐剂能够用于人类中。用vlp免疫动物时，通常不需要常规的那些佐剂，可以vlp内部包含cpg或ssrna等tlr配体，这些起到了佐剂的作用。病毒样颗粒保留了天然病毒颗粒的空间构象以及诱导中和抗体的抗原表位，免疫源性较强，不但能激发体液免疫反应，而且可以激发细胞和粘膜免疫反应，具有安全、高效的特点，是很有发展前景的候选疫苗或载体。目前利用 vlp作为疫苗的种类有以下几类：vlps 疫苗、嵌合 vlps疫苗、vlps耦联或交联疫苗[13]。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
本毕设课题的主要目标是构建带有绿色荧光蛋白的病毒样颗粒qβ，利用pet21-bl21大肠杆菌表达系统进行表达，它能够进行高效的自我组装形成病毒样颗粒，但是由于原核表达系统在大量表达病毒颗粒时容易产生包涵体且非目的蛋白的表达量会增多，这使得病毒纯化的效率会大大降低，所以我们通过预实验先确定vlp最适的表达条件后再进行大量表达，然后通过cscl密度梯度离心的方法将qβ-gfp 病毒样颗粒分离纯化出来，之后利用透射电子显微镜观察纯化后的样品，看qβ-gfp颗粒是否成功组装。之后我们将qβ-gfp通过皮下免疫和腹腔免疫的方法免疫野生型小鼠，利用流式细胞仪检测gfp发出的荧光，我们就能够直观的追踪抗原qβ病毒样颗粒引起的免疫反应以及其在各类免疫细胞中的动向。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法：
利用生物化学和分子生物学技术纯化出病毒样颗粒，免疫老鼠一段时间后取其免疫细胞进行流式染色，用流式细胞仪分选出含有绿色荧光信号的免疫细胞。
技术路线及实验方案：
4. 研究创新点
首次构建带有绿色荧光蛋白的病毒样颗粒Qβ，通过GFP荧光在体内追踪那些和病毒样颗粒结合或吞噬病毒样颗粒的各类群免疫细胞，以研究VLP免疫反应中的细胞学机制。
5. 研究计划与进展
2014.11.20至2014.12.06：收集资料，学习有关书籍文献，完成开题报告。
2014.12.08至2015.02.12：完成qβ-gfp表达载体的构建、qβ-gfp的分离纯化以及相关的鉴定步骤。
2015.03.11至2015.04.30：将已经纯化好的qβ-gfp病毒样颗粒通过腹腔注射、皮下注射等方法免疫野生型小鼠，利用流式细胞仪观察免疫一段时间后小鼠的引流淋巴结、脾脏、腹腔巨噬细胞中qβ-gfp的分布情况。
