1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.本课题的意义：总rna提取是紫背天葵相关分子生物学研究的重要基础，总rna的提取质量将直接影响后续的分子生物学实验研究，因此本实验诣在寻找一种总rna提取质量最优的提取方法。
2.国内外研究概况：紫背天葵（gynura bicolor(roxb.exwilld.)d.c）原产于中国，在南方多省均有分布和种植，具有药用和经济价值。
近年来，国内外学者关于紫背天葵的资源、栽培、化学成分、微量元素、营养与保健进行了较多的研究工作，并取得了一定的进展吗，但是对于分子生物学领域的研究目前较少。
2. 研究的基本内容和问题
1．目标：提取紫背天葵总RNA，达到理想的理化指标2．内容：以新鲜的或低温保存的紫背天葵叶片为实验材料，通过液氮研磨处理，再分别经过SDS法、CTAB法、Trizol法、异硫氰酸胍法这四种主要方法进行总RNA提取，获得的总RNA将进行浓度、纯度等理化指标测定，并通过电泳和紫外扫描进行检验，以此选择得到最优的提取方法并加以改良优化，确保最高效的提取质量最佳的总RNA3．拟解决：如何对比多种总RNA的提取方法进行试验，最终选择得到最优的提取方法
3. 研究的方法与方案
1．研究方法：先进行文献查阅，对于植物组织总rna提取方式进行归纳，再通过对比试验，选择提取紫背天葵总rna效率最高的实验方法2．技术路线：新鲜或－70 ℃保存的紫背天葵叶片液氮研磨分别采用sds法、ctab法、trizol法、异硫氰酸胍法提取总rna获得总rna浓度测定、电泳、紫外扫描通过理化分析选择最佳提取方法并改良优化3．实验方案：本研究主要采用sds法、ctab法、trizol法、异硫氰酸胍法sds法称取1.0 g新鲜或－70 ℃保存的紫背天葵叶片置于预冷的研钵中，加入少量 pvpp，加入液氮充分研磨成粉末状，转移至1.5 ml离心管中，加入 600 μl 提取液［0.1 mol /l tris－hcl( ph值9. 0)，含 15 μl β－巯基乙醇］旋涡混匀，室温静置15 min; 加入 250 μl 20% sds 裂解液， 轻轻混匀， 室温静置5 min， 12 000 r /min 离心 10 min; 取上清， 加 入 1 /3 体积的8 mol /l licl，上下颠倒混匀后， 于 4 ℃ 冰浴 2～3 h; 4 ℃ ，15 000 r /min离心 20 min，取上清; 用500 μl sste 溶解沉淀，再加入等体积的酚－氯仿 (1∶1 ) 涡旋混匀，12 000 r /min 离心 10 min; 上清转移至新的 1.5 ml 离心管中，加入等体积的氯仿旋涡混匀，12 000 r /min离心10 min; 取上清， 加入等体积异丙醇，－20 ℃ 放置2 h; 4 ℃，12 000 r /min 离心20 min，得沉淀，用体积分数为 75% 乙醇洗涤，将沉淀在超净工作台无rnase 环境中干燥; 加入 50 μl depc 水，充分溶解沉淀。
ctab法称取 1 ． 0 g 新鲜或 － 70 ℃ 保存的紫背天葵叶片置于预冷的研钵中 ， 加入少量 pvpp， 加入液氮充分研磨成粉末状， 然后转入 2支 1 ． 5 ml ep 管中 ; 加入 4 ml rna 提取液( 预先在 60 ℃ 水浴中保温 1 h) 和 80 μl β － 巯基乙醇并混匀; 加入等体积的氯仿 ∶ 异戊醇(24 ∶ 1 ) 混匀后 4 ℃ ， 12 000 r /min 离心 10 min，将上清液转移到另一离心管中 ， 重复抽提 1 次; 取上清液于另一支 1 ． 5 ml 离心管中 ， 加入 1 /4 体积的 10 mol /l licl 混匀，4 ℃ 沉淀过夜或 － 20 ℃ 沉淀 1 h; 4 ℃ 12 000 r /min 离 心20 min， 弃上清液， 将沉淀溶于60 ℃ 预热的 500 μl 纯化缓冲液中 ， 60 ℃ 温浴 5 min， 加入等体积氯仿 － 异戊醇(24 ∶ 1 ) ， 混匀; 4 ℃ 1 200 r /min 离心 10 min， 将上清液转移至 1 ． 5 ml 的ep 管中 ， 向上清液中加入等体积无水乙醇， － 20 ℃ 沉淀 1 h;4 ℃ 12 000 r /min 离心 10 min， 弃上清液， 用淀， 将沉淀在超净工作台无 rnase 环境中干燥; 加入 50 μldepc 水， 充分溶解沉淀 。
trizol法1. 0g 新鲜或 － 70 ℃ 保存的紫背天葵叶片置于预冷的研钵中 ， 加入少量 pvpp， 加入液氮充分研磨成粉末状， 转入盛有 1 ml trizol 的 1 ． 5 ml 离心管中 ( 分两管 ) ， 振荡混匀， 室温放置5 min左右， 4 ℃ ， 12 000 r /min 离心 10 min; 取上清， 用 ( 原 trizol 试剂 1 /5) 酸性酚和氯仿的 等体积混合物抽提， 混匀后，4 ℃ ， 12 000 r /min 离心 10 min， 重复 1 遍， 再用氯仿抽提 1遍; 将上清液转入新的 1 ． 5 ml 离心管中 ， 加入异丙醇( 原 trizol 试剂 1 /2) ， 混匀， 室温放置 15 ～ 30 min， 4 ℃ ， 12 000 r /min离心 20 min， 得白色沉淀; 加入体积分数为 75% 的乙醇漂洗，将沉淀在超净工作台无 rnase 环境中干燥; 加入 50 μl depc水， 充分溶解沉淀异硫氰酸胍法称取 1 ． 0 g 新鲜或 － 70 ℃ 保存的紫背天葵叶片置于预冷的研钵中 ， 加入少量 pvpp， 加入液氮充分研磨成粉末状， 加入至装有 rna 提取液(4 ml 的 4 mol /l 异硫氰酸胍和150 μlβ － 巯基乙醇 ) 中旋涡混匀， 室温静置 10 min; 用等体积的酚 ∶ 氯仿(1 ∶ 1 ) 抽提 2 次， 每次于 4 ℃ ， 12 000 r /min 离心10 min; 用 等 体 积 氯 仿 抽 提 1 次， 4 ℃ ， 12 000 r /min 离 心10 min， 取上清; 加入 2 倍体积无水乙醇; － 20 ℃ 放置 60 min，沉淀 rna; 4 ℃ ， 12 000 r /min 离心 10 min， 收 集 沉 淀 并 用75% 乙醇洗涤; 用 500 μl 无 rnase 水溶解沉淀， 加入等体积的氯仿旋涡混匀， 12 000 r /min 离心 20 min; 取上 清， 加 入1 /10 体积的 4 mol /l licl 和 2 倍体积的无水乙醇， － 20 ℃ 放置60 min; 4 ℃ ， 12 000 r /min 离心 20min， 得沉淀用体积分数为 75% 乙醇洗涤， 将沉淀在超净工作台无 rnase 环境中干燥; 加入 50 μl depc4．可行性分析：目前国内外均成功进行过多种植物的总rna提取，其中一部分种类的植物的组织含有酚类、花青素等天然活性成分，针对这些植物有着相适应的总rna提取方法，紫背天葵叶片所含化学物质与这些种类的植物近似，这些提取方法对于本实验研究有着一定的参考价值，因此本实验也具有较高可行性。
4. 研究创新点
国内外对于多种植物都进行过总RNA提取，包括一些富含多酚多糖类物质的植物总ENA提取，紫背天葵叶片含有与其近似的化学成分，但对于其总RNA提取的研究，国内外目前进行地较少；本实验进行多种实验方法的选择、对比，着重于实验方法的改良优化
5. 研究计划与进展
1．研究计划：2014年12月 文献查阅及文献综述整理2015年2月至3月实验方法总结及准备工作2015年3月至4月 对于各种实验方法进行预实验，并对于实验结果进行分析2015年4月至5月 通过实验结果分析，选择最优实验方法，并在此基础上进行改进及优化，获得理想的理化指标2．预期进展：中期检查前完成对几种实验方案的对比，中期检查后完成对最佳实验方案的选择及优化
