枯草芽孢杆菌凝乳酶的分离纯化开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

干酪因其营养丰富易消化在我国越来越受欢迎，随着其产量的不断增加，从小牛皱胃中提取的皱胃酶产量已经不能满足干酪生产的需要，迫使人们不得不寻找其它凝乳酶来代替小牛皱胃酶，因此凝乳酶的研究显得愈来愈重要。目前，国际市场上应用于干酪生产的凝乳酶主要有动物源凝乳酶、植物源凝乳酶以及微生物源凝乳酶。虽然动物凝乳酶凝活力与蛋白水解能力的比值高，但是动物生长缓慢且价格昂贵；植物凝乳酶蛋白水解能力强，其生产也受时间、地域等条件制约^[1]；利用微生物生产凝乳酶成本低，生产能力可以不受限制地扩大，已成为当前的研究热点。

在干酪生产中有1/3都是利用微生物来源的凝乳酶^[2]，微生物凝乳酶在世界上已成为仅次于淀粉酶的第二大商品酶。

丹麦干酪生产中来源于霉菌的凝乳酶得到广泛应用。日本、美国等国则将从微小毛霉菌中分离出的凝乳酶制成粉末凝乳酶制剂，应用到干酪的生产中。另外，还有其它一些霉菌性凝乳酶在美国等国被广泛开发和利用。我国也在20世纪80年代后期开始对微生物源凝乳酶进行研究^[3]。目前广泛得到应用的微生物有微小毛霉、米黑根毛霉、米曲霉、栗疫菌和枯草芽孢杆菌等。

2. 研究的基本内容和问题

微生物源凝乳酶已广泛应用于干酪生产，而枯草芽孢杆菌发酵生产的凝乳酶酶活较高，本课题旨在利用枯草芽孢杆菌发酵生产凝乳酶，并将凝乳酶分离纯化。得到高纯度的凝乳酶，利于后续的研究。

主要内容包括配制培养基发酵以获得发酵液，对发酵液进行二次硫酸铵分级沉淀，除去不需要的杂质蛋白。再经过DEAE-52离子交换和Sephadex G-75分子筛2次柱层析纯化，分离纯化蛋白。并利用SDS-PAGE电泳，分析纯化的凝乳酶的分子质量。

酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，酶的分离纯化最主要是保持酶的活性，只要有可能引起酶变性失活的因素都应注意，温度，酸碱度，重金属等。所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着每一步骤的取舍

3. 研究的方法与方案

本课题运用观察法和实验法，获得相关数据后再借助数学方法、统计方法进行加工整理，最后再分析数据，提出一个科学结论。

技术路线主要为：配制培养基→一定条件下发酵→发酵液8000r/min 低温离心10分钟取上清液→上清液进行硫酸铵分级沉淀→离心沉淀溶于磷酸缓冲液中得粗酶液→离子交换柱梯度洗脱→葡聚糖凝胶柱分子筛层析→sds-page电泳分析。

实验目的是分离纯化枯草芽孢杆菌凝乳酶，实验过程用到灭菌锅，超净台，摇床，冷冻离心机，恒流泵，自动收集器等仪器。实验过程同技术路线。

4. 研究创新点

微生物源凝乳酶研究主要在毛霉和曲霉，关于枯草芽孢杆菌发酵生产凝乳酶的相关文献国内较少，专门研究分离纯化的几乎没有。所以，本课题有一定的特色，且应用前景很广。

5. 研究计划与进展

2013.12-2014.1 进行预实验，确定硫酸铵分级沉淀的饱和度。

2014.3-2014.4 离子交换层析，梯度洗脱，通过酶活力测定确定ph和洗脱梯度。并进行电泳分析。

2014.4-2014.5 葡聚糖凝胶分子筛层析，收集吸收峰，测定酶活力确定酶活力峰，并进行电泳分析。