1. 研究目的与意义
课题内容：
本课题主要研究用考马斯亮蓝法测定乳糖中微量蛋白质杂质，将从标准品的线性考察和最低检测限这两个方面进行研究，主要以紫外-可见分光光度法进行深入探讨。首先通过标准品的线性考察算出线性方程。
考马斯亮蓝法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465 nm变为595 nm，蛋白质在1～1 000 u g范围内，蛋白质一色素结合物在595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。考马斯亮蓝法的突出优点是：（1）灵敏度高：蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug蛋白质。据估计比lowry法约高四倍。（2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰lowry法的k 、na 、mg2 离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 γ球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 triton x-100、十二烷基硫酸钠（sds）和0.1m的naoh，少量的去污剂可通过用适当的对照消除，而必要时必须预先处理样品。
2. 文献综述
考马斯亮蓝测定乳糖中微量蛋白质杂质
160203250杜颖
摘要：本课题主要研究用考马斯亮蓝法测定乳糖中微量蛋白质杂质，将从标准品的线性考察和最低检测限这两个方面进行研究，主要以紫外-可见分光光度法进行深入探讨。通过标准品的线性考察算出线性方程，考马斯亮蓝法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
3. 设计方案和技术路线
研究方案： 一、线性考察 精密量取对照品溶液，分别置具塞试管中，加水，再分别加入考马斯亮蓝试剂，立即混匀。照紫外-可见分光光度法（通则0401），立即在595nm的波长处测定吸光度，计算得出线性方程，同时以0号管作为空白。再取与对照品溶液浓度相对应的供试品溶液放入紫外分光光度仪中测吸光度，读取示数，代入线性方程得出蛋白质杂质含量。 二、最低检测限 将乳糖按一定浓度稀释，照紫外-可见分光光度法（通则0401），立即在595nm的波长处测定吸光度，再代入线性方程计算蛋白质杂质含量，将浓度持续稀释至测出吸光度接近0，此时的乳糖浓度即为蛋白质杂质的最低检测限。 三、加样回收率考察 C值：向已知的供试品中加入标准品，用上述紫外-分光光度法测出吸光度，即C值。 A值：为供试品所含被测成分量代入线性方程测出的吸光度，代入线性方程求出x值即为A值。 B值：为加入标准品的量即为B值。 技术路线： |
4. 工作计划
18.01.0418.01.26查阅整理课题相关文献资料并进行多糖的提取 18.01.2618.03.12熟悉课题实验方案，完成开题报告 18.03.1218.04.15线性考察 18.04.1618.05.15最低检测限和加样回收率的考察 18.05.0118.05.31整理总结实验数据，撰写毕业论文 |
5. 难点与创新点
本课题用考马斯亮蓝法测定乳糖中蛋白质杂质含量。目前，2015版国家药典尚未明确指出注射级乳糖的标准，但在实际应用中需要此级别的乳糖。本课题旨在建立能够检测乳糖中微量蛋白含量的方法，为未来生产注射级乳糖提供质量标准。
