三黄汤对幼龄蚂蟥生长及免疫的影响开题报告

一、本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

本项目的研究对象为水蛭的其中一种宽体金线蛭（Whitmania pigra Whitman），俗称蚂蟥，其干制品炮制后入药，具有破血、逐瘀、通经的功能，历来用于治疗症瘕、痞块、血瘀闭经、跌打损伤。近几年药材水蛭的市场需求增加，同时环境受到日益污染，从自然捕捞的方法收集到人工养殖是必然的趋势。随着对水蛭的研究日渐深入，人工养殖已经取得阶段性成果，但依然面临着诸多难题亟待解决。低温环境影响了蚂蟥的生长和其自身的免疫功能，导致生活力下降、死亡率升高，低温带来的病态是蚂蟥人工养殖的难点之一。目前国内外对蚂蟥的研究主要集中在其药材水蛭的药理作用、化学成分、临床作用等方面；在消化生理^[1]、组织结构^[2-3]等方面有一定基础；在对蚂蟥的消化生理的研究主要体现在摄食规律^[4]、消化酶^[1]的研究，对疾病预防方面的研究确鲜见报道。

目前，中草药作为生长促进剂、免疫调节剂在养殖业中得到了广泛的应用。其中，三黄汤，亦是三黄泻心汤，张仲景的《金匮要略》中由大黄、黄连、黄芩组成，本方为治疗热盛吐衄证要方。以黄连泻心清胃，燥湿解毒；黄芩泻肺燥湿解毒；大黄泻火通腑泻毒，引火下行。故全方能泻火解毒，燥湿泻热。主治胃火炽，破火妄行，以致吐衄，目赤，口舌生疮，湿热黄疸，霍乱等症^[5]。其药理作用主要表现在泻下作用^[6-7]、促凝或止血作用^[8-9]、抗病原微生物的作用^[10-12]等；在出血性疾病^[13]，感染性疾病^[14-15]，肛肠疾病^[16-17]等方面具有较佳疗效。运用中医药原理和方法，部分研究已有初步成效。其中动物生长力、抗病力，黄永春^[18]发现，单位药茯苓能明显促进凡纳滨对虾的生长，而黄芪、板蓝根、柴胡和甘草可以明显提高其抗病力；在复方中草药运用中，王东梅^[19]用9味中药混合加入饲料中，发现其能提高刺参的免疫功能；陈芳园^[20]研究得出三黄泻心汤水提物能抑制体外主要致病菌痤疮丙酸杆菌的生长繁殖；Shih YT 等^[21]研究了三黄泻心汤以及其主要成分黄芩苷对幽门螺旋杆菌感染的人胃上皮AGS 细胞的抗炎效应；王帅^[22]等研究报道三黄汤能显著改善大鼠结肠黏膜的充血水肿、溃疡、糜烂。

蚂蟥生长状况与存活率是养殖过程中的重要部分，本实验研究三黄汤对低温环境下蚂蟥生长及免疫的调节作用，旨在探究三黄汤对蚂蟥生长状况及免疫作用的影响，为提高蚂蟥的生活力及免疫力，有助于蚂蟥顺利养殖，为蚂蟥健康繁殖与疾病防治提供理论基础。

参考文献

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三、研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

3.1 研究方法

将蚂蟥置于20的光照培养箱中进行养殖，时间60天。取三黄汤煎液（1g/ml），稀释成3、1.5、0.3、0.15、0.03、0，6个浓度处理蚂蟥幼苗，分别为A、B、C、D、E、O组，25℃下进行养殖试验。结束后，计算存活率，增重率和特定生长率并进行方差分析。对处理后的各组蚂蟥均取样，取其消化道制作石蜡切片并观察。另取样，采用异丙醇提取蚂蟥RNA，从而进行反转录，用荧光定量PCR技术检测生长基因GH（生长激素）、免疫基因Cu-SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（过氧化氢酶）、AKP（碱性磷酸酶）的表达量。

3.2 技术路线

3.3实验方案

3.3.1蚂蟥模型的建立

将蚂蟥置于20的光照培养箱中进行养殖，时间60天。

3.3.2.不同浓度的三黄汤分别对蚂蟥进行处理

所得的蚂蟥分组别于不同浓度的三黄汤中，模型造好后，试验用蚂蟥按质量、体积大小均匀分配到6个组中，分5个不同浓度三黄汤组别和1个模型组，分别标记为：模型组O，实验组A(3.00)，B(1.50)，C(0.3) ，D(0.15)，E(0.03)。平均每组15条左右，每条单独饲养于玻璃罐中，全部置于25℃下，共10d，期间以天然饵料螺蛳常规饲喂，每隔三天换一次水，加一次药，处理结束时，计算存活率、增重率和特定生长率，对增重率和特定生长率用SPSS软件，并使用最小显著差数法（LSD）和多重比较法（Duncan）进行方差分析（ANOVA），统计整理数据。

3.3.3.石蜡切片的制作

分别取各浓度蚂蟥消化道组织固定于固定液中过夜，70乙醇过夜，梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡和包埋，切片、脱蜡、染色、制片、镜检。

3.3.4荧光定量PCR技术

取整只蚂蟥进行RNA的提取，若跑胶不成功则重新提取；若成功，提得的RNA进行反转录，得到DNA，选定生长基因GH（生长激素）、免疫基因Cu-SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（过氧化氢酶）、AKP（碱性磷酸酶），再通过PCR 法将微量 DNA 进行目的片段扩增，检测反应液中 SYBR Green I 的荧光强度，观测监控 PCR 产物扩增量的多少，同时，对比各浓度组扩增量差异。

3.4可行性分析

（1）正式实验之前，已试用0.3浓度的三黄汤处理大蚂蟥，大部分大蚂蟥生活力有明显提高，因此，在0.3上下一定范围内设置浓度梯度，以确定最适宜的浓度。

（2）实验采用的各方法石蜡切片的制作方法、RNA的提取技术、跑胶技术、RNA的反转录技术、荧定量PCR技术均有明确流程，应用广泛，技术成熟。

（3）已有完备的实验场所和实验仪器，蚂蟥养殖基地可作为实验的主要研究场所，电子显微镜、微型离心机、反转录仪、定量PCR仪等为主要的实验设备，上述两者保证了本实验的顺利实施。