1. 研究目的与意义
1、本课题的意义 水蛭，俗称蚂蟥，为环节动物门水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman的干燥全体，是中国传统的特种药用水生动物，其干制品泡制后中医入药，具有治疗中风、高血压、清瘀、闭经、跌打损伤等功效。近年新发现水蛭制剂在防治心脑血管疾病和抗癌方面具有特效。因此，近些年来，蚂蟥逐渐成为中成药和保健品行业的新宠，在市场上被广泛应用。因而其市场供需量逐渐增大，养殖产业也逐渐壮大，各类养殖方法也在不断的改进和完善。本实验旨在研究外源雌激素，主要是17β-雌二醇，水浴处理一段时间后对蚂蟥生殖细胞发育的影响，这一实验对蚂蟥的人工养殖和关于性腺组织形态学上的研究都有非常重要的意义。 2、国内外研究概况、应用前景等 人类在医疗中应用水蛭的历史可追溯到古埃及、古罗马和古希腊时期，世界上最早关于医用水蛭的记载应是公元前1500年中东巴比伦时代楔形文字的描述，著名法国历史学家波斯图的历史名著中就收录有16世纪中叶应用水蛭治疗血瘀证和慢性炎症而引起的轰动性效应，在许多人看来，利用水蛭治病是一种古老的医术。如中世纪的古希腊和古印度利用水蛭实施放血疗法，目的是将人体内多余的坏血排出体外达到治病的目的;又如古代我国传统医学认为，水蛭具有逐血破淤，消炎解毒和通经利水道的功效。可见，在水蛭治病疗效显著的观点上，东西方医学基本是一致的。 近年来水蛭的研究多注重于药理和药效及生理方面的比较研究,但有关水蛭性激素的研究未见报道，目前激素的研究在鱼类或者和水蛭同为雌雄同体的黄鳝中均仅有部分研究。以近年来发表的文献为依据系统总结了水蛭的化学成分、药理研究、临床应用及毒副作用的研究概况。近年来水蛭的化学成分研究有颇多成果，相继分离出以水蛭素为代表的多肽和蛋白类等大分子、以糖脂类、羧酸酯类和甾体类等物质以及分析鉴定的脂肪酸酯和甾体类化合物为代表的小分子和各种微量元素、氨基酸。水蛭具有突出的药理作用，具有抗凝、抗血栓、纤溶、抗炎、保护血管内皮细胞、抗细胞凋亡、抗肿瘤、抗纤维化、抗增殖、抗血液流变学、调节血脂、抗早孕等多种药理药效。随着技术的发展、研究的日益深入，水蛭越来越广泛的应用临床，在脑血管病、心血管病、高脂血症、肾脏疾病、肺脏疾病、妇科及其他疾患中有着良好的医学应用前景。针对水蛭的毒性，查阅了国内外有关文献，结论有待商榷。 国外主要从日本蛙中提取有效成分，其中最主要的是水蛭素。水蛭素可以与凝血酶(thrombin)按11的比例以非共价的形式紧密结合成可逆复合物，从而阻止凝血酶催化的止血反应及凝血酶诱导的血小板激活反应，达到抗凝血的目的。据报道水蛭素是迄今为止世界上发现的最强的天然凝血酶抑制剂。 [1]虞森，吴淑春，食品中性激素多组分残留分析方法的概述[J]食品工业科技：10.13386/j.issn1002-0306.2010.02.060 |
3、主要参考文献
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2. 研究内容和预期目标
4、研究的目标、内容
本研究在蚂蟥生长发育期间的一个月份内，即在蚂蟥孵化出后的2月龄到3月龄期间，用17β-雌二醇水浴养殖蚂蟥40天，并设置五个不同的浓度梯度，这五个浓度组分别为：1g/l、10g/l、50g/l、100g/l、200g/l。再加上一组正常养殖的空白对照，在尽可能保持其他条件相同的情况下养这六组蚂蟥一个月，然后取出一部分做石蜡切片，在光学显微镜下观察它们的生殖细胞变化差异；另一组则取出分别测其体内激素浓度变化及其差异。主要研究在外源雌激素刺激下，蚂蟥体内激素和其生殖细胞的变化。
5、拟解决的关键问题
3. 研究的方法与步骤
6、研究方法和技术路线
本实验设计主要运用文献分析法、文本细读法、比较法、综合分析法等方法进行研究。
外源雌激素水浴处理蚂蟥一个月 |
生殖细胞组织切片 |
测体内各激素含量变化 |
观察分析对比 |
观察分析对比 |
7、实验方案及可行性分析
雌激素水浴养殖2月龄蚂蟥一个月后，取一部分做石蜡切片，在光学显微镜下观察生殖细胞变化；取另一部分做体内激素含量测定。
可行性分析：
石蜡切片的技术已经经过很多人并花费长时间的完善，在生殖细胞组织切片的操作上问题不大。在将蚂蟥用10乙醇溶液迷晕后，待其自然舒展开身体即开始固定，解剖蚂蟥卵巢、精巢等性腺部位组织。切片制作的主要的操作步骤为：将组织置于Bouin氏固定液中8-24小时来固定；再先投入到梯度乙醇中脱水，后放入二甲苯中透明；再用已经于恒温箱中融化好了的石蜡渗蜡；后包埋和修切蜡块；最终上切片机切片；切好后的样经过脱蜡和HE染色后再用中性树脂封胶保存；最后用光学显微镜观察并拍照。
在国内外对鱼类的性激素的提取和检测方法已经比较成熟，激素提取部分主要针对雌二醇、雌三醇、睾丸酮、孕酮这四种具有代表性的內源性激素做定性定量实验，性类固醇激素提取检测方法重点参考了鱼类、黄鳝等多种动物内源激素的提取、检测方法。
提取方法包括：液相萃取法、固相萃取法、超临界流体萃取法、冷冻离心除脂法、加速溶剂萃取法等；检测方法包括：分光光度法、免疫学检测法、高校液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法、高校气象色谱串联质谱法等。
本研究的实验室中设备基本齐全，各类试剂充足，并且有专业老师莅临指导。
4. 参考文献
8、特色或创新之处
本实验是首次对蚂蟥用雌激素水浴处理，通过石蜡切片观察蚂蟥性腺组织形态，用高效液质联用仪定性定量內源激素含量，观察同一时期的外源性内固醇激素对蚂蟥体内生殖细胞的发育和內源性内固醇激素水平的影响。总体探索了不同浓度的外源雌激素对蚂蟥整个生殖细胞的影响。这对外源性内固醇激素的合理应用是个大的进步。本研究不仅可以丰富蚂蟥生物学基础研究，同时也为蚂蟥人工繁育提供了科学指导和理论依据。
5. 计划与进度安排
9、研究计划及预期进展
（1）2022.2.1-2022．3.1
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