水氮互作对菘蓝生长、光合生理及药材质量的影响开题报告

1. 研究目的与意义

水分和养分是影响作物生产的两大主要因子，二者既彼此孤立又相互影响。水分对植物生理代谢具有重要作用，同时也影响药用植物次生代谢产物合成。氮作为植物所需的大量元素之一，是其体内重要物质的组成成分，如核酸、蛋白质、酶、叶绿素等^[1]。氮素水平影响药用植物的生长发育，对其生理生化反应强度、途径起着调节作用，从而影响其初生和次生代谢^[2]。菘蓝（isatis indigotica fortune）为十字花科植物，其干燥根与叶分别为药材板蓝根和大青叶^[3]。在其栽培生理研究发现中，淹水条件与干旱条件下，菘蓝分别表现出不同的适应性 ^[4-5]，在菘蓝的生长过程中，氮营养不仅影响菘蓝生长，也影响其体内活性成分积累^[6]。实际生产中，有效协调水分和养分关系，不仅可以提高作物产量和水分利用效率，同时也能促进药用植物的次生代谢以提高其活性成分含量，是优质高产栽培中的主要农艺措施^[7-8]。

水氮互作对于水稻的氮素的吸收及利用效率，对氮代谢酶活性都有显著影响^[9]。通过适宜的水氮耦合调控，创造良好的根系形态、提高根系活力和氮代谢酶活性，将更有利于提高产量及氮肥利用效率^[10]。适量施氮和灌水，小麦的旗叶光合速率显著提高，籽粒产量增加；在灌溉底墒水、冬水、拔节水和开花水的基础上增加灌浆水，施氮量由180 kghm^-2增至240 kghm^-2，旗叶光合速率、sps活性和蔗糖含量提高，但籽粒产量显著降低^[11]。在正常生长条件下，供水对小麦光合特性和籽粒产量的影响大于氮肥，而增加施氮量却能明显弥补水分亏缺造成的不利影响，适度水分亏缺与正常施氮水平为最优的水氮互作模式，可使黄淮冬麦区小麦水分利用效率和产量均达到最高^[12]。干旱胁迫处理下增施氮肥能提高花生产量，改善花生根系的生长，增加40 cm以下土层内的根系生物量、根长和根系表面积，提高花生根系伤流强度^[13]。崔红艳等^[14]的研究表明，水氮协调在胡麻干物质积累和分配中起着关键的作用，而干物质的积累和分配又与籽粒产量密切相关。施氮150 kghm^-2处理下胡麻茎秆含氮量较施氮75 kghm^-2和225 kghm^-2处理极显著高出10.05% -23.58%。水氮互作条件下，施氮150 kghm^-2 ，灌水2次或3次能够促进胡麻苗期、分茎期、青果期和成熟期根系和茎秆含氮量，且该处理根系含氮量较施氮75 kghm^-2现蕾期灌一次水处理极显著高4.13 %^[15]。

目前关于菘蓝栽培生理多集中于单一营养因子或单一水分的影响，缺乏水氮互作对其生产与药材质量影响的研究，为此以菘蓝为试验材料，采用盆栽方式，进行水氮互作处理，以其光合参数与叶绿素、叶内靛蓝与靛玉红、根内多糖与蛋白、根内的（r,s）-告依春含量为指标，研究水氮互作对菘蓝生长、光合生理与药材质量的影响，以期为菘蓝栽培生产中水分与氮营养的最佳利用提供理论参考。

2. 研究内容和预期目标

研究目标:

采用避雨盆栽方式，二因素裂区试验设计，以菘蓝的生物量、叶绿素含量、光合参数、叶内靛蓝与靛玉红含量、根内蛋白、多糖以及(r,s)-告依春含量等为指标，研究水氮互作对菘蓝光合生理及药材质量的影响，为菘蓝的优质栽培提供理论参考。

研究内容：

3. 研究的方法与步骤

研究方法：

（1） 叶绿素和光合参数测定 采样前8:00~11:00，选择菘蓝植株由内至外的第三片功能叶片，用SPAD502叶绿素测定仪测定其叶绿素含量，并用LI-6400型光合仪在1000 μmolm^-2s^-1的光子强度下，测定同一位置菘蓝叶片的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO₂浓度（Ci）和蒸腾速率（Tr），根据净光合速率和蒸腾速率计算水分利用率（WUE），即WUE = Pn/Tr，每个处理测定6张叶片。

（2） 生长指标测定 完成叶绿素及光合参数的测定后收获、采样，分析不同处理菘蓝地上与地下部分生长状况。将菘蓝植株用蒸馏水洗净、擦干，称单株鲜重，每个处理取8株，计算其平均单株重，测定菘蓝地上部分长度为其株高，并测定其主根中部的直径、主根长度、每株的分根数，之后将其分成地上和地下两部分，分别称重，计算根冠比，然后在105 ℃下杀青5 min，并于60 ℃下烘至恒重，称其干重。

（3）靛蓝与靛玉红含量测定 参照《中国药典》（2015版）高效液相色谱法测定叶片中靛蓝、靛玉红的含量。色谱条件：流动相为甲醇：水=72:28，流速为0.300 mLmin^-1，检测温度为30 ℃，检测波长为289 nm，各处理组3次重复。

（4）（R,S）-告依春的含量测定 参照中国药典（2015版）的方法测定菘蓝根中（R,S）-告依春的含量。色谱条件：以甲醇-0.02%磷酸（7:93）为流动相；检测波长为245 nm，各处理组3次重复。

（5）多糖含量测定 称取0.2 g菘蓝根的粉末，用蒸馏水在沸水浴条件下提取1 h，采用苯酚-浓硫酸法测定根内多糖含量。以葡萄糖为标准品作标准曲线，根据标准曲线计算多糖含量，各处理组3次重复。

（6）可溶性蛋白含量测定 称取0.2 g菘蓝根的粉末，用蒸馏水在沸水浴条件下提取1 h，采用考马斯亮蓝G-250法测根内蛋白含量，各处理组3次重复。

（7） 总氮含量测定 称取0.3 g菘蓝根、叶的粉末，经高温消化后用全自动凯氏定氮仪测定根叶总氮含量，各处理组3次重复。

技术路线：

实验方案：

（1）实验材料 试验材料为来自于甘肃陇西菘蓝栽培居群，实验采用避雨盆栽方式，盆栽（外口径34 cm，底直径22 cm，高30 cm）试验，栽培基质为蛭石和珍珠岩按2:1比例混合而成。栽培的基本营养液配方中大量元素和微量元素均采用霍格兰营养液配方，基本营养液pH 6.0。处理营养液的氮元素均由硝酸铵NH₃NO₃提供，通过改变硝酸铵NH₃NO₃的用量来控制氮的浓度，pH 6.0，所用试剂均为分析纯(AR)。

（2）实验设计 采用二因素裂区试验设计，水分处理为主区，氮素营养为副区，水分处理设计为不淹水W0、轻度淹水W1、中度淹水W2，氮素营养设计为氮素缺乏N0（0 mmolL^-1）、低水平供氮N1（5 mmolL^-1）、中等水平供氮N2（15 mmolL^-1）、与高水平供氮N3（25 mmolL^-1），共12个组合，处理重复3次，随机区组排列（表1）。 2015年7月2日播种，出苗后每隔20 d浇灌一次基本营养液，每次每盆1L，待菘蓝幼苗长至4~5片真叶时间苗，保证每盆留有长势基本一致的菘蓝幼苗6株，于2015年9月17日进行水分与氮素的互作试验。其中，水分处理通过淹水深度控制，分别在盆的1/3高度和2/3高度打孔，置于大号周转箱内，往周转箱内灌水，使淹水刚好没过小孔，即分别为轻度和中度淹水，同时进行氮素处理，每盆浇灌1L不同氮素浓度的营养液。

表1 水氮互作的试验处理

Table 1 The treatments of water-nitrogen interaction experiment

可行性分析：

（1）客观条件（栽培条件，实验室条件，仪器设备条件等）：

① 课题研究思路明确，技术方案可行。本项目依托于中药学教学实验中心和园艺学院科研平台。研究在中药学教学实验中心进行，中药学教学实验中心的栽培与质量分析实验室设施完备，在试验基地、实验方法和仪器设备条件等方面均已成熟，故此研究切实可行。

② 高液相色谱仪、总氮测定仪、分光光度计等必备的仪器设施齐全；

③ 部分药品、试剂可直接从实验室获取。

（2）主观条件（指导老师，项目成员基础）：

① 项目由长期从事菘蓝研究的专业导师指导，本人为中药学专业学生，又学过无机化学、有机化学、生物化学、药用植物学等相关课程，查阅过相关的资料文献，有一定的理论基础支撑；

② 本科期间做过相关的课程实验，药用植物学实验、化学实验（I、II）、生物化学实验，仪器使用熟练，有一定的实验基础和研究基础；

③ 在实验开始之前，阅读过大量的相关文献，制定了完备、可靠的实验方案，因此准备工作相当充足。

综上所述，本项目研究切实可行。

4. 参考文献

目前关于菘蓝的研究主要集中在化学成分、药理活性、制剂工艺、临床应用及组织培养等方面，菘蓝栽培生理研究多集中于单一营养因子或单一水分的影响，缺乏水氮互作对其生产与药材质量影响的研究，为此以菘蓝为试验材料，采用盆栽方式，进行水氮互作处理，以其生物量、光合参数与叶绿素、叶内靛蓝与靛玉红、根内多糖与蛋白、根内的（R,S）-告依春含量为指标，研究水氮互作对菘蓝光合生理与药材质量的影响，以期为菘蓝栽培生产中水分与氮营养的最佳利用提供理论参考。

5. 计划与进度安排

研究计划及预期进展：

本研究预期在24个月内完成：2022年5月-2022年5月。

2022年5月：进行前期工作，查找文献资料，完成研究方案的设计。