1. 文献综述
研究现状及发展趋势：
肝纤维化是继发于各种慢性肝损伤的一种肝脏组织修复机制，几乎所有慢性肝脏疾病都会诱
发肝纤维化的发生，如酒精性肝损伤、病毒性肝炎及脂肪肝等[1, 2]。
肝纤维化主要是由于肝脏部位
细胞外基质（extracellular matrix, ecm）的过量沉积所致，如若得不到有效干预或治疗，肝纤维化
会进一步发展成为肝硬化甚至是肝癌[3]。
已有研究表明，肝星状细胞（hepatic stellate cells, hscs）
活化被认为是肝纤维化发生的关键环节，活化的 hscs 会转化为肌成纤维细胞，进而产生大量的
胶原和其他的 ecm，沉积于肝脏表面，从而诱发肝纤维化[4]。
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2. 研究内容和问题
基本内容：
构建 CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型，腹腔注射不同剂量的芒柄花素（Formononetin, FMN），
HE 检测芒柄花素对 CCl4诱导大鼠肝脏损伤的影响；试剂盒检测芒柄花素对 CCl4诱导大鼠肝脏中
ALT、AST 及 ALP 水平影响；Masson 染色及天狼猩红染色检测芒柄花素对 CCl4 诱导大鼠肝脏胶
原沉积影响；试剂盒检测芒柄花素对 CCl4 诱导大鼠肝脏组织中羟脯氨酸水平影响；Western blot
检 测 芒 柄 花 素对 CCl4 诱 导 大 鼠 肝 脏 组织 中肝 纤 维 化 标 志 蛋白 α-SMA 、 Fibronectin 及
α1(I)procollagen 表达影响。
预计解决的难题：
芒柄花素体内是否具有抗肝纤维化的效应？
3. 设计方案和技术路线
一、大鼠肝纤维化模型构建及给药处理[1]
将 40 只雄性 sd 大鼠随机分为 5 组，分别为组 1：对照组（control）；组 2：模型组（model）；
组 3：fmn 低剂量组（12.5 mg/kg）；组 4：fmn 中剂量组（25 mg/kg）；和组 5：fmn 高剂量组
（50 mg/kg），每组 8 只。fmn 剂量的选择依据前期预实验结果。对照组腹腔注射给予等量的橄榄
油，模型组及 fmn 低、中、高剂量组采用腹腔注射 ccl4构建大鼠肝纤维化模型。ccl4与橄榄油
按照 1:1 的比例（体积比）混合，并以 1 mg/kg 的剂量给予大鼠腹腔注射。第 2、3、4、5 组的大
鼠每两天给予 ccl4腹腔注射一次，持续 8 周。受试物 fmn 先用 dmso 溶解，然后用玉米油稀释
至特定浓度。在 5-8 周，fmn 通过腹腔注射给予大鼠，每天一次。实验结束后，大鼠给予 50 mg/kg
的戊巴比妥进行麻醉，通过眼眦后静脉丛取血，然后手术剥离大鼠肝脏。切除一小块肝脏用福尔
马林浸泡，进行后续病理和免疫组化研究。剩余的肝脏切碎，置于液氮中冷冻，后续提取肝组织
蛋白和 mrna。
二、he 检测大鼠肝脏病理损伤
取浸泡于福尔马林溶液的肝脏组织，经脱水、浸蜡等过程制作成蜡块，并进行石蜡切片。切
片厚度一般为 3-5 mm，然后进行染色，首先用二甲苯脱蜡 20 min，无水乙醇洗去二甲苯 10 min，
然后用 95%和 80%乙醇各洗 10 min，之后用自来水小心冲洗 1 min，再用蒸馏水小心清洗 1 min。
之后用苏木素染色 4 min，并用自来水清洗 2 min。用 1%盐酸酒精分化 20 s，并用自来水清洗 2 min。
之后用 1%稀氨水返蓝 30 s，自来水清洗 2 min，蒸馏水清洗 1 min。然后用伊红染色 90 s。紧接着
用 80%乙醇脱水 10 s，95%酒精脱水 10 s，再用无水乙醇脱水 5 min。用二甲苯处理 20 min，最后
用中性树胶封片。显微镜拍照观察肝脏病理结构。
三、羟脯氨酸水平检测[2]
羟脯氨酸的提取：取约 0.2 g 肝脏样本于玻璃管，加入 2 ml 的组织提取液，置于 110℃烘箱，
水解 6-12 个小时，16000 rpm，25℃，离心 20 min，用提取液定容至 2 ml，取上清液待测。具体
检测步骤参照试剂盒说明进行。
四、马松染色[3]
将石蜡切片脱蜡至水，依次用自来水和蒸馏水清洗，用试剂 a 染核 10 min，然后充分水洗，显
蓝后镜检，至胞核呈蓝色为止；继续用蒸馏水清洗，烘干玻片；将干燥好的玻片水平放置在免疫
组化湿盒上，在标本上，滴加数滴试剂 b，染液覆盖住标本即可。水平放置，室温染色染色 10-20
min。使用试剂 c，清洗玻片，去除染液 b，每次 3 分钟，3 次；甩干玻片上的水分，滴加试剂 d
水溶液分化处理 3-5 min；用滤纸滤去试剂 d，注意滤纸不要接触到样本。不经水洗，直接用试剂
e 染 5-15 s；紧接着以试剂 c 水溶液清洗玻片，去除多余染液，使染色色调清晰鲜艳即可，最后用
95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固，显微镜下拍摄。
五、天狼猩红染色[4]
1. 样品处理：对于石蜡切片：二甲苯中脱蜡 2×5min；无水乙醇 5 min、90%乙醇 2 min、70%
乙醇 2 min；pbs 漂洗 2 min；2. 天狼猩红染液：1) 苏木素染核 8 min，用自来水漂洗切片 10 min；
2) 用天狼猩红染液染色 1 h；3) 用酸化水漂洗切片 2 次，每次 5 min；4) 用吸水纸吸去切片上的
多余水分；5) 用 100%乙醇脱水 3 次，每次 3 min；6) 用二甲苯透明 2 次，每次 5 min，然后用树
脂封片，显微镜下拍照。
六、western blot 检测蛋白表达[5]
1）蛋白提取：将 100 mg 左右的肝脏组织用冰生理盐水充分洗涤后，剪碎，将剪碎的肝脏组
织放入匀浆器中，加入含蛋白酶抑制剂的裂解液 900 μl 充分匀浆后，置于冰上裂解 40 min。4°c，
12000 rpm 离心 5 min，取上清加入蛋白上样缓冲液，煮沸 5 min 后，分装保存备用。2）bca 蛋白
定量：设置空白孔、标准曲线（0.025，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 μg/μl）、稀释 10 倍的样品
孔，加入 bca 工作液 37 ℃孵育 30 min 后 562 nm 处测定 od 值。按照样品体积加入相应体积的 5×
上样缓冲液，混匀后 95 ℃煮蛋白 10 min，冷却存于-80 ℃超低温冰箱中；3）上样、电泳及转膜：
根据不同的抗体决定不同的上样量（20~50 μg），恒压 80v 进行电泳。结束后将胶转移至 pvdf
膜上，恒流 260 ma 低温湿转 90 min；4）封闭及孵育抗体：将 pvdf 膜沉没在 5 %的脱脂奶粉中
常温封闭 2 小时后，每 10 min 用 tbst 洗膜 1 次，共 3 次。吸干 pvdf 膜上的残留液体置于塑封
膜当中，加入相应的一抗（acsl4、patched、smo、hhip）后封口，放置于 4℃冰柜中摇床过夜；
5）敷荧光二抗及显影：回收一抗，tbst 洗膜 3 次后每张膜加入 2ml 的荧光二抗（1：5000）室温
避光孵育 2 h，再次用 tbst 洗 3 次，li-cor 显影机显影，image j 分析条带。
技术路线：
芒柄花素→整体水平构件四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型→1.he检测病理损伤
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4. 工作计划
1. 项目成员已经熟练掌握本实验所需要的实验技术；
2. 本项目研究将依托于南通大学药学院药理平台，实验室具备常规开展细胞学及分子生物学等
实验项目的条件，且南通大学动物实验中心为整体水平的研究提供了平台，为本研究有关项
目的实施提供保障；指导老师长期从事肝纤维化基础药理研究，擅长各种肝纤维化模型的构
建，并具有较好的分子生物学研究基础，对整个课题研究具有很好的把控。
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