透明质酸-量子点-美法仑体系的合成及体外评价外文翻译资料

英语原文共 8 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

透明质酸-量子点-美法仑体系的合成及体外评价

1.摘要

近年来世界范围内普遍的癌症增长率已经使癌症疗法成为最热门的研究之一。已经做出巨大努力来改善治疗方法，面对有效的癌症治疗的最重大挑战是细胞毒性药物的全身毒性由于它们的非特定的属性，其缺乏肿瘤本地化的，并且在整个主体上的均匀分布。此外，抗癌药物在血液循环和其不希望的药代动力学行为的短半衰期是存在于癌症治疗的方法的其他缺点之一。所有这些负面影响限制了大多数抗癌药物的临床应用。因此，出现了急于寻求发展安全，高效的药物载体，可以向目标靶点指定提供抗癌药物，而不在肿瘤治疗中挑起不良反应。因此，低分子量的抗癌药物与聚合物载体中的缀合物开始结合的聚合物药物偶联通常增强抗癌药物分子的分布。高分子偶联药物的主要优点包括：(1）增加在低可溶性的水溶解度或在水溶性药物，并且因此，增强了药物的生物利用度的;（2）失活和流通过程中的活动保存药物的保护;（3）药物抗原活性的降低使免疫学身体应答的抗原性活性的降低;和（4）最重要的是，能够具体地到作用部位提供药物的主动靶向。

透明质酸(Hyaluronan acid，HA)，是一种天然酸性多糖大分子，由N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸双糖单元组成，被普遍认为无毒，可生物降解。研究表明，HA具有较弱的肝受体特异性和较低的肝脏积累以及较好的隐形性（类似于聚乙二醇（PEG）的隐形性），同时，透明质酸酶广泛分布于肿瘤细胞外基质，对肿瘤的生长、侵袭和转移，起到了重要的作用。HA在体内主要被透明质酸酶降解，透明质酸酶为一种酸敏感性酶，其最适pH值为3.5-5.5。在血液中，较高的pH值（7.35-7.45）使得酸敏感性透明质酸酶失活，HA不被降解，可保证给药系统在血液循环过程中药物不被释放；在肿瘤部位（组织或细胞），较低的pH值使HA能够被透明质酸酶有效水解，从而使药物定位释放。这些都将有助于增强HA负载的药物在肿瘤部位的积累。

量子点（quantum dots，QDs）作为一种具有独特光学和化学性质的新型荧光探针，在细胞、活体的荧光成像以及生物活性物质的定性、定量方面都有较好的应用前景，与传统的有机荧光原料相比，具有不可比拟的优点 ：激发光谱宽，可用单一激发波长同时激发不同颜色的量子点；发射光谱窄而对称，可减少检测中的光谱重叠，提高检测的灵敏度；荧光发射波长可由量子点大小和组成元素调控；发光强度比传统荧光物质强 10倍以上，荧光寿命强。虽然组成量子点的化学成分Cd和Se等元素对细胞和组织有毒害作用，但经亲水性和功能化处理的量子点则表现出良好的生物兼容性( biocompatibility)。

美法仑（MEL），也称为L-苯丙氨酸氮芥，是一种有效的抗癌药物，并已被广泛使用的ASA化疗剂。然而，MEL是高度反应性的，其可以容易地与其他细胞成分包括蛋白质和核酸，导致治疗活性的丧失和许多不希望的副作用，例如骨髓毒性和遗传毒性的挑衅反应。此外，它是水不溶性的这导致非常低的生物利用度在这项研究中，HA-QDs-MEL偶联物的开发是为了对乳房肿瘤治疗的自组装纳米颗粒。正如预期的那样，它对乳腺肿瘤有主动靶向能力和生物利用度的改进。结果表明，该偶联物具有体外药物释放，细胞毒性性质，和细胞摄取特性的理想特性，这表明了其作为未来的抗癌药物的潜力。

2.主要试剂和材料

试剂：氧化镉 (99.5%)、碲粉 (99.99%)、硫化钠(98.2%)、硼氢化钠（96%）、 L-半胱氨酸（98.5%）3-巯基丙酸（98.5%）、 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）(99.98%)无水乙醇(99.7%)、氢氧化钠(99.0%)、溴化钾（光谱纯99.0%）、二甲亚砜(99.0%)、氘代二甲亚砜(99.9%)、丙酮(99.5%)、无水乙醚(99.7%)、透明质酸(99.0%)，美法仑（98.5%）; SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；其他试剂 ( 国药集团化学试剂有限公司)仪器： Inova 400 MHz 核磁共振仪 ( 美国Va r i a n 公司); Lambda-850 紫外分光光度计； Ls55 荧光分光光度计 ( 美国Perkin-Elmer 公司); JEOL JEM-200CX 透射电镜 (TEM, 日本JEOL 公 司)；TNZ1-5700傅立叶变换红外光谱仪(美国Nexus Thermo nicolet公司)；D/MX-ⅢA X射线衍射仪 (RIGAKU公司)；ZDG-3真空冷冻干燥机(浙江真空设备集团有限公司) RE52C旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；GL-12B高速离心机(上海沪粤明科学仪器有限公司)

一、不同稳定剂修饰的量子点制备

1）L-Cys修饰的CdTe/CdS核壳结构量子点的制备

前驱液的合成：

将0.037 g硼氢化钠和0.053 g碲粉(摩尔之比为1:1)，放入10 mL的小圆底烧瓶中，氮气保护的条件下注入3 mL的蒸馏水，常温下磁力搅拌4 h以上，得到黑色的含Te的前驱液NaHTe。

反应方程式：4NaBH4 2Te 7H2O→2NaHTe Na2B4O7 14H2uarr;

CdTe的合成：

称取0.6 mmol L-Cys（240.3----0.144）加入到40 mL去离子水中溶解，再量取3 mLCdCl2（183 45=228）水溶液（0.037 mol/L）加入，以0.5 mol/L的NaOH溶液调至pH为8，再将混合液转移至50 mL三颈瓶中，通氮气20 min后，注入全部的新鲜前驱液NaHTe，迅速升温到105 ℃，并进行磁力搅拌进行回流。CdCl2·2.5H2O、NaHTe和L-半胱氨酸的摩尔比为1∶1∶1.5。回流反应1 h，得到透明淡黄色CdTe量子点溶液。

L-Cys-CdTe/CdS的合成：

将1 mLNa2S溶液(7.5 mmol/L),用10 min注入到以上量子点中滴入到CdTe量子点溶液中。继续加热回流1 h,最终形成CdTe/CdS核壳型量子点。将溶液旋转蒸发，用无水乙醇及丙酮提取，使溶液沉淀形成分散的细小固体，冷冻离心，真空干燥，得到L-Cys-CdTe/CdS量子点固体粉末。

2）MPA修饰的CdTe/CdS核壳结构量子点的制备

CdTe量子点的制备：

前驱液的制备：与L-Cys-CdTe/CdS量子点的合成方法一致。量取3 mLCdCl2水溶液（0.037 mol/L）加入到40 mL去离子水中，再精密量取加入137 micro;L MPA，以0.5 mol/L的NaOH溶液调至pH为10，再将混合液转移至50 mL三颈瓶中，通氮气20 min后，注入全部的新鲜前驱液NaHTe，迅速升温到90 ℃，并进行磁力搅拌。CdCl2·2.5H2O、NaHTe和巯基丙酸的摩尔比为4∶1∶3。回流反应1 h，得到CdTe量子点溶胶。

MPA-CdTe/CdS核壳结构量子点的制备：

与L-Cys-CdTe/CdS量子点的合成方法一致。将溶液旋转蒸发，用无水乙醇及丙酮提取，使溶液沉淀形成分散的细小固体，冷冻离心，真空干燥，得到MPA-CdTe/CdS量子点固体粉末。得到的固体进行红外扫描和X射线衍射表征。

3) CA-CdTe/CdS量子点的合成

CdTe量子点的制备：

前驱液的制备：与L-Cys-CdTe/CdS量子点的合成方法一致。称取0.192 gCdCl2·2.5H2O和0.154 gCA加入到40 mL去离子水中，用稀HCl溶液调至pH为5～6，装入到三颈瓶Ⅱ中；再称取0.053 g碲粉，加入10 mL去离子水中，转入三颈瓶Ⅰ中；用通气管将Ⅰ与Ⅱ相连，通氮气20 min后，将0.037 g硼氢化钠加入3 mL去离子水中，注入到三颈瓶Ⅰ中，96 ℃下回流搅拌，加入0.5 mol/LH2SO4溶液，直至反应完全。CdCl2·2.5H2O、NaHTe和巯基丙酸的摩尔比为2∶1∶4.8。回流反应2 h，得到CdTe量子点溶胶。

CA-CdTe/CdS核壳结构量子点的制备：与L-Cys-CdTe/CdS量子点的合成方法一致。待反应结束以后，将溶液旋转蒸发，用无水乙醇及丙酮提取，使溶液沉淀形成分散的细小固体，冷冻离心，真空干燥，得到CA-CdTe/CdS量子点固体粉末。

二、靶向示踪体系的制备

1.量子点先与透明质酸反应缩合，最后接美法仑

QDs-HA的制备：取0.1gHA溶于5mlPBS（PH7.4）加入0.06gNHS室温磁力搅拌30min，然后加入纯化后的CdTe/CdS量子点溶液5ml并称取0.05gEDC加入反应液中避光磁力搅拌2h。取出上述反应液避光透析24h，冷冻干燥，既得具有荧光QDs-HA固体粉末。

QDs-HA-MEL的制备：

将HA-QDs 0.3 g，室温避光磁力搅拌至HA-QDs全部溶解，加入5 mg/mL的BA-MEL水溶液（pH4.7）30mL，室温避光磁力搅拌12h， pH为7.4的磷酸盐缓冲液透析3天，再用双蒸水透析2天。冷冻干燥得反应物粉末，即得产物HA-QDs-MEL。

2.美法仑先与透明质酸反应缩合，最后接量子点

HA-MEL的制备：

取0.1gHA溶于5mlPBS（PH7.4）加入0.06gNHS室温避光磁力搅拌30min，同时称取0.05gMEL溶于5 mlDMSO中加入0.05gEDC室温避光磁力搅拌30min，然后混合两者，避光磁力搅拌过夜。

HA-MEL-QDs的制备：

将上述溶液中加入5ml量子点，避光磁力搅拌数小时，在不同时间段观察其荧光，然后用双蒸水透析2天,冷冻干燥到具有荧光的的产物HA-QDs-MEL。

3.美法仑先进行酯化保护后再与透明质酸反应缩合，最后接量子点

BA-MEL的制备：

在装有温度计、分水器的三颈烧瓶中加入美法仑0.5g，苯甲醇12-14ml，冰浴下用恒压漏斗滴入二氯亚砜4ml,在磁力搅拌下进行反应1h；然后在60℃下回流12h,产物用乙醚析出，然后用饱和碳酸氢钠、蒸馏水洗涤，得到淡黄色的固体BA-MEL。

HA-BAMEL的制备：

取0.1gHA溶于5mlPBS（PH7.4）加入0.06gNHS室温避光磁力搅拌30min，同时称取0.05gBA-MEL溶于5 mlDMSO中加入0.05gEDC室温避光磁力搅拌30min，然后混合两者，避光磁力搅拌过夜，然后用双蒸水透析2天,冷冻干燥到具有荧光的的产物HA-QDs-BAMEL。

1. 靶向示踪体系的产品表征

靶向示踪体系的红外表征

HA的特征基团是羧基和仲酰胺基团，在HA的红外图谱中可见3300~2500 cm-1是HA缔合的O-H吸收峰，峰形宽而散，强度很大。1614.36 cm-1是sigma;C=O 游离的C=O由于发生共轭转移的吸收峰。1423 cm-1是sigma;C-O 吸收。sigma;C=O，仲酰胺 1680~1655 cm-1，sigma;N-H仲酰胺 游离位于~3440 cm-1，形成氢键而缔合的位于~3100 cm-1，均呈单峰；仲酰胺1500~1530 cm-1。sigma;C-N 酰胺的第Ⅲ谱带，仲酰胺 1300~1260 cm-1。HA-QDs的特征峰与HA相同，由于量子点的重金属影响，整体发生偏移，其他特征峰还在，而且量子点中的伯胺 3500~3300 cm-1有两个中等强度的吸收峰，在此区域只有一个吸收峰，是因为通过氨基与羧基的偶联生成仲氨键，所以说明透明质酸成功偶联量子点。

在HA-MEL-QDs的红外图谱里面中多了美法仑的苯环特征峰，其他的特征还在。1601 cm-1，1585 cm-1， 1425 cm-1sigma;C=C 芳环的骨架伸缩振动，这是苯环的主要特征峰，1275—960 cm-1为delta;Ar-H。 810~750 cm-1,725~680 cm-1为1,3-二取代苯，这些特征峰说明成功在HA-QDs上偶联美法仑。

pH值和透明质酸酶对HA-QDS-MEL给药系统释药的影响

称取一定量的冻干的HA-QDS-MEL胶束溶解在pH分别为5.8、7.0和7.4的PBS缓冲溶液中，按上述方法计算出美法仑的浓度，绘制出HA-QDS-MEL给药系统释放量对时间的曲线

HA-QDS-MEL给药系统在不同pH值PBS中的体外释药

HA-QDS-MEL给药系统的细胞毒性实验

收集对数期人乳腺正常细胞(HBL-100)与人乳腺肿瘤细胞(MDA-MB-453)，倒置显微镜观察到HBL-100细胞与MDA-MB-453细胞贴壁后加样，分别加入各组别样品MEL、HA-QDS、HA-QDS-MEL给药系统、HA(d)-QDS-MEL（HA-QDS-MEL给药系统的降解产物），每组取5个浓度10ug、20ug、40ug、80ug、160ug，每孔100ul，每个浓度设5个平行孔，在浓度为5%的二氧化碳，温度为37℃细胞培养箱孵育48h后，取每种细胞的板，用PBS(pH=7.4)缓冲液冲洗2遍，加入100ul无血清培养基，并且在每个有样孔加入0.5%MTT溶液20ul，放入相同培养箱中继续培养，计时，在培养4h后终止细胞培养，用移液器吸走孔内混合培养液，然后在每个孔中再加入二甲基亚砜150ul，并置于摇床上低速振荡10min，使孔内结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值，同时设

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[148133]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word