聚乙二醇在皮肤损伤模型中的应用外文翻译资料

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纳米羟基磷灰石/复合PLGA-(PEG-A_SP)_n：一种新的仿生骨组织工程支架材料

郭晓东 袁泉 郑启新 段子霞 潘正奇 赵明（1.Dept.of骨科，协和医院，同济医学院，科学与华中科技大学，武汉430022，中国）

全大萍（高分子材料科学，化学与化学工程学院的2.Institute，中山大学，广州510275，中国）

摘要：

纳米羟基磷灰石PLGA-(PEG-A_SP)_n复合材料是一种通过仿生自组装方法组成的新型仿生骨组织工程支架材料。纳米羟基磷灰石PLGA-(PEG-ASP)n复合材料作为一种新型可降解的材料，其中的PLGA-（PEG-A_SP）_n共聚物具有侧胺官能团并拥有更强的亲水性，它通过本体开环共聚合成，这个过程是通过DL-丙交酯（DLLA）和乙（GA）用天冬氨酸（A_SP）- 聚乙烯乙二醇（PEG）alt-预聚物。通过溶剂浇铸,颗粒浸出的工艺制备一种拥有三维多孔支架的PLGA-（PEG-ASP）n共聚物，然后，由钙离子结合，SEM，肿块增大测量和内磷酸盐含量这种方式来测定支架在改进的模拟培养体液（SBF） . HA纳米晶体的多孔支架的内孔表面上的增长. SEM分析表明，连续的类骨的成核和生长，低结晶碳酸在PLGA-（PEG-ASP）n的内孔表面支架上的HA纳米晶体. 钙的结合量，总质量和磷酸盐对实验PLGA-（PEG-ASP）n的支架在MSBF不同温育时间的质量比PLGA支架中更大。这PLGA-（PEG-ASP）n复合材料同时在主成分和微观层次表现出了天然骨的一些特征. 在ASP-PEG ALT-预聚物改性PLGA共聚物中提供一个可控的高表面密度和阴离子官能团的分布，这将加强成核现象和类骨矿物在mSBF中的呈现. 该仿生治疗在组织工程学上不仅促进了表面的功能化，而且对于随后的矿物成核现象也提供了一种简单的方式，在可生物降解的聚合物支架上自组装.

关键词：骨组织工程;仿生材料;生物矿化;自组装;聚（D，L-丙交酯 - 共 - 乙）;羟基磷灰石

1引言

通过移植骨组织材料的更换和具有组合物组织工程的产品，我们追求的目标是模仿天然组织生物学特征和结构[1]。聚乳酸（PLA），聚乙醇酸（PGA），以及它们的共聚物（PLGA）在组织工程中得到了广泛的应用。然而，这些聚合物不具有对生物矿化足够的阴离子官能团，从而限制了它们的应用。因此，引入足够的阴离子的官能团到这些大分子和控制其内容和空间分布是生物矿化与组织工程的一个重要挑战 [14-16]。聚乳酸(PLa) ,聚轻基乙酸(PGa)以及两者的共聚物(PLGa)具有良好的生物相容性、可降解吸收性，是目前组织工程研究中应用最为广泛的一类材料;然而，这类材料存在的不足是亲水性和细胞亲和性不够理想。为从分子结构上改善PLGa材料的亲水性和细胞粘附性，赋予最终材料生物学功能，本文合成了分子链中含具有能与肤链结合的氨基活性位点的氨基酸结构、亲水性强以及对细胞和多肤蛋白相容性好的聚乙二醇(PEG)链段的PLGA-(PEG-ASP)n新型共聚物。

尽管-COOH，-NH 2，和-OH的基团已经被成功地引入到可生物降解聚酯的事实，一些报告中表明在阴离子官能团和空间的调节中找到主要分布在聚合物主链上的链段，它是通过结构和序列的调整来分配含官能团。

聚（乙二醇）（PEG）具有突出的亲水性，并能降低蛋白质的非特异性效应吸附和聚集胶体.氨基酸是生物可吸收的并且它们的功能基团可与生物活性分子被联结. 因此，结合的PEG链段和氨基酸单元进PLGA聚合物链可以为他们提供更好的亲水性和相对大量的阴离子官能团的. 此外，官能团和共聚物的性质的密度可以通过控制PEG链段的长度进行调整[14-16].

氨基酸作为生物的重要组成部分,从赋予聚乳酸类材料生物学功能的角度出发,在它们的分子中引入氨基酸结构单元或链段,自然受到材料和生物学家的重视,已有许多相关研究报道.考虑到聚乙二醇(PEG)亲水性强以及对细胞和多肽蛋白(如生长因子)相容性好的特点,本文设计在将氨基酸引入到PLGA分子中的同时,又引入PEG链段,使合成的共聚物分子中既具有大量可控的能与肽链结合的活性位点,又有亲水且对细胞和多肽蛋白相容性好的PEG链段,而材料同时又可降解吸收,从而合成了具有生物活性的高分子材料.

在这项研究中，我们开发的方法是通过分层的办法来模仿天然材料形成过程，以产生具有受控物质材料同时具备在微米和纳米结构中扩展。一个新的仿生骨组织工程支架材料，纳米羟基磷灰石PLGA-[ASP-PEG]复合材料，是由仿生自组装合成生物矿化的研究途径。

2实验

2.1　原料和试剂

N-(苄氧羰基)-L-天冬氨酸(N-CBz-L-ASP) (ACROS ORGANICS公司);PEG,平均分子量为200,进口分装,用前于120℃减压干燥24 h;D,L-LA(实验室合成)和GA(北京康安高分子开发中心),经乙酸乙酯多次重结晶纯化;Sn(Oct)2,工业品,使用前经减压蒸馏;Pd(5 wt%)-C催化剂,参照文献[9,10]制备;对甲苯磺酸·H2O(CP,常州市新华活性材料研究所);氯化亚砜(SOCl2)、二甲苯、氯仿、乙酸乙酯、无水乙醚、石油醚、邻苯二甲酸酐、吡啶、咪唑、氢氧化钠(均为AR,广州化学试剂厂).

2.2　PLGA-(PEG-ASP)n共聚物的合成

2.2.1　 N-苄氧羰基-L-天冬氨酸酐(Ⅱ)的制备[6,7]　　

由N-(苄氧羰基)-L-天冬氨酸(N-CBz-L-ASP)(Ⅰ)在氯化亚砜的催化脱水作用下生成.产物的元素分析结果(%),C(57.12); H(4.53); N(5.47),理论值(%),C(57.83); H(4.41); N (5.62),实验结果与理论值相接近.实验测得产物的熔点为118～ 120℃ .

2.2.2　(PEG-ASP)n预聚物的合成[6,7]　　

由单体Ⅱ和PEG200通过溶液缩聚法制备.对甲苯磺酸·H2O为催化剂,用量为0.12 mol%;二甲苯为溶剂;反应48 h.

2.2.3　PLGA-(PEG-ASP)n共聚物的合成　　

采用本体封管聚合方法制备.将一定量的单体D, L-LA、GA(D,L-LA GA摩尔比:75 25)和单体总质量5%,10%和15%的(PEG-ASP)n预聚物装入经过硅烷化处理并充分干燥的安瓿瓶中,催化剂Sn(Oct)2用量为单体总质量的0.03%,抽真空脱去溶剂、水分和氧后,熔封反应瓶,于160℃真空烘箱里反应24 h.粗产物经氯仿溶解,酒精沉淀纯化处理.纯化后的产物于40℃减压干燥至恒重,储存于干燥器中备用.

2.2.4　侧氨基上保护基团的脱除反应[6,7,11]　　

将1g的PLGA-[(PEG-ASP)n-10%]共聚物溶解于20 mLDMF中,然后加入0.5 g的Pd(5 wt%)-C催化剂,电磁搅拌下于25℃通H2反应48 h.结束反应后,共聚物溶液前后经滤纸过滤、0.2mu;m过滤头过滤和高速离心分散纯化.将滤液倒入大量的蒸馏水中,所得沉淀物于40℃减压干燥至恒重.

2.2聚合物支架准备

一种新型的可生物降解PLGA-（PEG-ASP）n共聚物具有侧挂胺官能基团被大批开环聚合合成. 所述PLGA-（PEG-ASP）n共聚物的三维支架是通过溶剂浇铸，颗粒沥滤工艺制造.支架是直径为圆盘5mm且厚度为2毫米，孔径范围为通过使用氯化钠粒子直径为受控200-300微米的处理. 以前的结果表明，PLGA-（PEG-ASP）N共聚物的亲水性相比所述的PLGA得到显著的改善.

2.3钙离子结合分析

每个单位量的八聚合物支架在含有2毫升溶液的24孔组织培养板中孵育，将它们分别分为六个独立的钙离子浓度依次为（0.05，0。1，1， 5，和10mM）使溶液维持150毫摩尔NaCl并缓冲至pH= 70.4，保持37℃室温. 培养48小时后，通过总钙的量减去钙结合到每个支架添加到溶液的量，来测得在溶液中钙的剩余的量. 使用比色测定法来测定在各溶液中钙的浓度.

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2.4矿化

PLGA-（PEG-ASP）n或PLGA支架分别置于24孔组织培养皿. 然后，他们分别在一个15毫升改进的模拟溶液（SBF）中进行了为周期0，4，8，12日和16天的矿物生长培养. 溶液用每日新制备的MSBF替换，以确保离子浓度保持在一定的范围. MSBF通过以下试剂溶解于去离子中制备:141 mM氯化钠，40.0毫KCl，03.5毫米硫酸镁，1.0毫氯化镁，40.2毫碳酸氢钠，50.0毫氯化钙，2.0毫米磷酸二氢钾. 所得到的溶液进行缓冲至pH= 6.8,37℃，以防止磷酸钙相的均相沉淀. 在MSBF孵育每个支架被分析前后都要进行冷冻干燥.

2.5表征矿物增长

SEM观察：培养不同时间后，导电金涂层通过溅射涂覆脚手架施加到每个表面，在成像高真空中使用日立S-520 SEM观察样品在支架表面的矿物增长.

质量增加测量：对每个支架在MSBF中孵育的前后测定质量.通过计算得出在PLGA-（PEG-ASP）n支架的质量的百分比在PLGA支架有了提高[11-13]. 磷酸含量的测量;以下MSBF孵育，支架干燥，并在5.0M硫酸溶液孵育对矿物溶解. 将1.0毫升完全溶解的溶液等分试样加入到1.0毫升水，1.0毫升的10mM钼酸铵和2.0毫升丙酮，组成的4.0毫升溶液.磷酸盐的量通过测量检测到的的400纳米波段上的721型分光光度计吸光度进行定量，磷酸盐用于定量测定的标准为一个相关系数较大于或等于0.999为浓度范围60-300mu;M[11-13].

统计分析：所有的数据表示为算术平均值plusmn;标准差（xplusmn;S）. F检验是用于比较几个显著方差数据组.这个方法的意义在于通过方差分析来检查数据之间的差异. P lt;0.05的值才是有意义的.

3.结果与讨论

PLGA (PEG AsP)_n共聚物的结构

图I为(PEG ASP )_n预聚物、PLGA和PLGA-(PEG-ASP)n共聚物的红外谱图。从图中可看出，与P LGA的IR谱相比较，PLGA (PEG ASP)n的IR谱图上在1 524 cm-¹处出现一新的吸收峰，该吸收峰应为(PEG ASP )n链段中的C一N伸缩振动峰。

图2为预聚物和脱除CBz保护基团前后PLGA-(PEG-ASP)n共聚物的1H-NMR谱。参照文献[4,5,9,10],预聚物和共聚产物中各质子共振峰的归属如图所示。其中,delta;= 4.3处为PEG末端单体结构单元分别与酯羰基和羟基相连的亚甲基质子共振峰;delta;= 3.6(d)处为PEG主链上的亚甲基质子共振峰;delta;= 7.3(i)处为(PEG-ASP)n链段上的L-天冬氨酸单元上的芳香环中的质子共振峰,共聚物侧氨基上的CBz基团经脱除后,该共振峰消失,表明采用催化加氢法,以Pd-C为催化剂,直接通H2可完全脱除共聚物侧氨基上的CBz基团。共聚产物的1H-NMR谱结果与IR谱图结果相一致,表明本文采用本体封管聚合方法,以Sn(Oct)2为催化剂、(PEG-ASP)n为共引发剂引发D,L-LA和GA开环共聚,成功地合成了PLGA-(PEG-ASP)n新型共聚物。

PLGA-(PEG-ASP)n共聚物的性能

以聚苯乙烯为标样测定的(PEG-ASP)n预聚物和PLGA-(PEG-ASP)n共聚物的数均分子量 (Mw)和分子量分布宽度(Mw/Mn)列于表1。从表中可看出,共聚物的分子量明显大于预聚物;脱除CBz基团后共聚物的分子量大于按脱保护基团前共聚物的分子量计算得到的理论值,且还略大于脱保护基团前共聚物的分子量。这可能是脱除共聚物侧链上的CBz基团后,共聚物的流体动力学体积增加或分子间形成了氢键的缘故。

PLGA-(PEG-ASP)n共聚物的DSC结果显示,共聚物的DSC曲线上只有一个玻璃化温度转变,未见熔融峰,表明共聚物为非晶态聚合物;共聚物的玻璃化转变温度(Tg)介于预聚物和PLGA的Tg值之间(见表1)。这一方面是因为在PLGA分子链中引入了PEG柔性链的缘故,同时也说明PLGA嵌段与预聚物嵌段是互容的。共聚物侧氨基上的CBz基团经脱除后,共聚物仍然为非晶态聚合物;共聚物的Tg值略有升高。这可能是由于脱除CBz基团前后共聚物的分子链段的运动相似以及脱除CBz基团后分子间形成了氢键的缘故

PLGA和脱除CBz基团前后PLGA-(PEG-ASP)n共聚物薄膜的表面接触角见表1。从表中可看出,PL-GA分子中经引入(PEG-ASP)n链段后,材料的表面接触角明显下降。液滴接触角可反映材料亲水性的强弱,表面接触角小,材料的亲水性好,液滴易于在材料表面铺展。因此,实验结果表明PLGA-(PEG-ASP)n共聚物的亲水性优于相应的PLGA。

以PLGA和PLGA-(PEG-ASP)n共聚物为原料制备薄膜材料,将体外培养传代至第3代的骨髓基质细胞(MSCs)分别种植在两种共聚物薄膜上继续培养,24 h后观察如图3所示:在PLGA-(PEG-ASP)n薄膜上粘附的细胞成片生长,密度较大,细胞呈梭形或圆形;彼此连接在一起,而在PLGA共聚物薄膜上粘附的细胞较分散,密度较小,细胞多呈圆形;并且,PLGA-(PEG-ASP)n薄膜的细胞粘附数和粘附效率均明显高于相应的PLGA薄膜。这说明在PLGA共聚物分子中引入含氨基酸结构、亲水性强以及对细胞和多肽蛋白相容性好的PEG链段的(PEG-ASP)n预聚物后,有效改善了PLGA共聚物的细胞粘附性和生物相容性。

钙结合PLGA支架的量是明显小于钙结合到PLGA-（PEG-ASP）N每个钙浓度支架（Plt;00.05）（图.1）此外

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