在头颈部鳞状细胞癌YWHAZ / 14-3-3ζ拷贝数增加和致癌活性外文翻译资料

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在头颈部鳞状细胞癌YWHAZ / 14-3-3zeta;拷贝数增加和致癌活性

摘要

基因扩增是癌基因激活的一种常见机制，已被应用于癌症的治疗中新癌基因的发现。在头颈部鳞状细胞癌(HNSCCs)的拷贝数经常增长等众多详细事件和潜在致癌基因已经被报道。最近,我们应用限制具有里程碑意义的基因组扫描(针对)研究基因扩增HNSCC和异常，一个个地区原发性肿瘤样本。获得q22.3 8号染色体上的位置YWHAZ(14-3-3zeta;),在30 - 40% HNSCC病例。数据来自荧光原位杂交(FISH)和免疫组织化学HNSCC组织微阵列证实过度频繁的低级YWHAZ拷贝数增加和蛋白质。YWHAZ mRNA在病人的肿瘤组织频繁调节。此外,YWHAZ RNAi显著抑制HNSCC细胞系的生长速率,和超表达YWHAZ HaCaT永生的人类皮肤角化细胞促进生长,以及形态学变化。YWHAZ水平降低G1 / G0-phase比例增加,降低了s阶段比例和DNA合成的速率。根据这些证据,我们建议YWHAZ候选人原癌基因,它在HNSCC致癌作用值得进一步调查。

关键字

HNSCC;放大,致癌基因;YWHAZ / 14-3-3zeta;

介绍

在许多癌症中发现DNA扩增是一种常见的基因变化¹。亚染色体单位是DNA特定区域的放大导致额外的副本，,可能包含增长促进致癌基因。DNA扩增结果在目标基因位于放大区域的超表达,从而赋予生长优势²。致癌基因的超表达导致肿瘤转换和赋予的优势通过提供抗凋亡刺激³或促进加速细胞生长⁴。放大在致癌作用和致癌基因的超表达是一个早期事件¹,因此可以作为诊断早期发现肿瘤细胞的标志或预测结果的临床治疗。此外,激活癌基因为癌症治疗提供潜在目标如图所示在食道癌MYC或在肺癌表皮生长因子受体^5，6。在早期的研究中,我们使用限制具有里程碑意义的基因组扫描(针对)定位小说和已知的染色体区域显示拷贝数增加⁷。在这些地区,我们发现致癌基因,人脉广泛的HNSCC致癌作用,包括PI-3激酶催化alpha;亚基(PIK3CA)染色体3 q26.3,原癌基因(MYC)8 q24.21或细胞周期蛋白D1(CCND1)q13.3 11日。此外,其他特异和频繁上涨3 q29和8号染色体上q22.3被识别和确认。这些改变在大约30 - 40% HNSCC病例和认为是频繁变更。致癌基因在这些地区尚未确定。趣的是,针对片段2 c13 q22.3 8日,确认为经常获得序列位于5′外显子的酪氨酸单氧酶/色氨酸5-monooxygenase激活蛋白,zeta(YWHAZ)14-3-3zeta;同种型。

14-3-3基因家族在1967年首次在牛脑蛋白质分类8中发现。目前通过哺乳动物系统已确定914-3-3基因的七个不同亚型beta;,gamma;,ε,eta;sigma;,tau;,zeta;)由七个不同的基因编码。14-3-3蛋白家族成员都是同源或异源二聚化的10个28-33 kDa蛋白。二14-3-3分子绑定到特定的荧光粉的丝氨酸/苏氨酸（PS / T）-含图案，其中的两个rsxpsxp和rxxxpsxp 11，12。许多分子调节细胞信号转导（PKC，RAF1，cttnb）和细胞凋亡（坏，Bax）被认为与14-3-3蛋白13-17，使他们掌握这些监管机构的监管。参与癌症的证据来自于研究14-3-3sigma;（14-3-3sigma;，ywhas或SFN），这是经常发生的，在各种癌症中过度表达在18-20调节但别人，可能在细胞应激反应21-23。其合作的几个监管机构阻止细胞周期的进展使14-3-3sigma;理想的抑癌基因

在这项研究中，我们假设YWHAZ可能该染色体区域赋予细胞生长优势的靶基因。此外，14-3-3基因家族的研究，关于YWHAZ功能详细的知识是有限的。以前的报告表明，在口腔表达YWHAZ，胃癌和肺癌27-31

与后者的肿瘤类型也显示基因扩增。。在这项工作中，我们研究了头颈部鳞癌患者YWHAZ在DNA，mRNA和蛋白水平表达。在这里，我们表明，当它受到消极或积极的操纵时，具有控制细胞生长的能力，同时也影响细胞周期。探究活化基因如何对肿瘤起到作用。

材料和方法

HNSCC患者样本

提取RNA，逆转录合成cDNA及进行半定量RT-PCR检测

从额外的44对患者的正常组织和肿瘤组织中提取RNA，用Trizol试剂盒提取样本中的RNA。用逆转录酶反应合成DNA，每1-2mu;g RNA与0.5mu;G（DT）和2mu;G随机引物，与脱氧核苷三磷酸（dNTPs）（10mm）在65°C提供RT-PCR缓冲5分钟（Invitrogen）。加入50u SuperScript II（Invitrogen）在42.0℃反应50分钟，然后在70摄氏度的条件下热灭活15分钟，剩下的RNA模板用RNase37°C孵化20分钟。-20℃保存所得产物

我们在一个Bio-Rad循环系统中用荧光染料掺入法对YWHAZ和GPI基因水平进行了测量在一个Bio-Rad循环系统中。数据通过循环次数的和软件生产数据的阈值的交叉处理获得。在CT YWHAZ和GPI的差异平均（Delta;CT）从正常组织被定义为基底层（BL）。标准化的YWHAZ cDNA水平可以通过公式1.9（Delta;cttumor BL）计算（1.9是通过校准实验确定的每一个周期的放大倍数）。我们限定正常的YWHAZ表达的BL值在0.5-2之间。引物序列是流放在表1

头颈部鳞癌组织芯片的构建（TMA）

组织芯片由从先前样本中得到的33个样本构成

从用48%福尔马林固定的、石蜡包埋的HNSCC肿瘤组织块上取三份1mm厚的组织，并将其平行包埋进一个新的蜡块中。受到控制的样本来自10种器官标本包括心脏、结肠、肾、肾上腺、卵巢、子宫、脑、甲状腺、肺和前列腺。

荧光原位杂交和免疫组化染色

YWHAZ的荧光原位染色利用BAC克隆rp11-302j23（chr8：102004801-102195725，UCSC基因组生物信息学，损坏2006发布），通过PCR验证包含YWHAZ基因。按照之前所描述的准备和扫描荧光原位染色的幻灯片。YWHAZ信号和CEP8的比值测定至少60个无核重叠的间期肿瘤细胞核YWHAZ信号CEP8的比值。没有信号或只有一个颜色的信号的细胞被忽视。肿瘤细胞显示至少两个着丝粒染色体信号和多个YWHAZ信号，满足YWHAZ：CEP8ge;2，可以认为是获得的YWHAZ基因一致性很好。肿瘤细胞显示至少两个着丝粒染色体8号和YWHAZ信号个数相等，YWHAZ： CEP8比小于2，和YWHAZ基因不呈正向关系。肿瘤细胞显示多个CEP8信号和YWHAZ信号数量大致相等，有点随机分布，被认为是8号染色体多体。

免疫组化染色福尔马林固定，石蜡包埋切片法。

免疫组化染色法基于福尔马林固定，石蜡包埋切片法。石蜡包埋的组织被切成4微米，放置在带正电荷的载玻片上。载玻片标本被放置在一个60°C烤箱烘烤1小时，冷却，和脱蜡和通过二甲苯、梯度乙醇溶液水化。所有的载玻片放入3%过氧化氢溶液中的水5分钟，以阻止内源性过氧化物酶对样本产生影响。将载玻片放入含有柠檬酸盐缓冲溶液的蒸锅中对抗原进行修复。将载玻片放入达科Autostainei 中，开启免疫模式，进行免疫组化。原代兔多克隆抗YWHAZ抗体克隆C-16（圣克鲁斯生物，圣克鲁斯，CA）1:1500稀释，孵育60 min，检测系统使用一个标记的聚合物体系，设想加双链路（Dako码数k4061）。染色与DAB显色（Dako码数k3468）。载玻片在李察艾伦苏木精复染、通过梯度乙醇溶液脱水、封片。

细胞系的培养

四头颈部鳞癌细胞株（umscc-8、- 9、- 11B和22b）和一个永生化人皮肤角质形成细胞（HaCaT）维持和生长在DMEM培养基（含10%胎牛血清的DMEM培养液）（FBS）和1%链霉素和青霉素（S / P）抗生素。

RNAi转染

炒负控制RNAi和YWHAZ RNAi此前公布的31点通过QIAGEN（瓦伦西亚，CA）。用脂质体Lipofectamine 2000转染试剂（Invitrogen）混合，以1:1的比例与RNAi（V／V）在室温下孵育20 min细胞在无血清培养液为阴性对照或与YWHAZ RNAi 6小时，然后是10%胎牛血清的DMEM培养基中定期更换。选择的RNAi序列不影响水平的14-3-3beta;和tau;亚型已检测过31。RNAi序列列于表1

Western印迹法

从100毫米菜细胞用胰蛋白酶消化，收获，裂解，裂解缓冲液中含有0.1%的NP-40和磷酸酶抑制剂的鸡尾酒。10mu;G细胞裂解液电泳12%聚丙烯酰胺凝胶，然后转移到膜上的杂交ECL硝酸纤维素膜（GE医疗生命科学，皮斯卡塔韦，新泽西州）。对于标准的西方协议，在室温下3%个小时的膜被阻塞了2个非脂肪乳。在一个用TBS洗涤缓冲液（0.1%的吐温20），足够的抗体进行孵育1小时，15分钟后洗两。过氧化物酶结合的二次抗体与膜孵育1小时。以下两个额外的洗了supersignal信号（皮尔斯生物科技，罗克福德，IL）和放射自显影检测蓝膜（ISC bioexpress，凯斯维尔，UT）。抗体浓度如下：兔抗YWHAZ（圣克鲁斯生物）、1:1000；鼠抗alpha;微管蛋白（Calbiochem，San迭戈，CA）、1:1000；小鼠抗HA标签克隆6E2（细胞信号技术，丹弗斯，MA）、1:1000；小鼠抗E-钙粘蛋白（圣克鲁斯生物）、1:100；小鼠anti-n-cadherin（圣克鲁斯生物技术）、1:200；小鼠抗波形蛋白（圣克鲁斯生物）、1:100；羊抗兔抗小鼠，辣根过氧化物酶标记（Bio-Rad）、1:5000

细胞生长曲线法

二万头颈部鳞癌细胞或HaCaT细胞接种于六孔板或60毫米菜取决于个体细胞的增殖潜能。治疗后，细胞用胰蛋白酶消化和细胞计数（贝克曼库尔特，富勒顿，CA）每日最多5天。每组实验至少重复两次。

对HaCaT细胞株的建立表达YWHAZ

从质粒pcDNA3 YWHAZ哈33 ywhaz-ha片段经BamHI和EcoRI切下，然后将其克隆到逆转录病毒载体的研究。该研究YWHAZ HA质粒转染包装细胞汇合凤凰40-50% Superfect转染试剂（盒）4小时，然后用10%胎牛血清的DMEM培养基。孵育48小时后，收集上清液放置在40-50%汇合的HaCaT细胞中存在的8mu;克/毫升48小时血。转染细胞进行2mu;g/ml嘌呤霉素

流式细胞仪和BrdU掺入法

流式细胞仪检测指数期细胞DNA含量（碘化丙啶，PI）和DNA合成率的BrdU（5′-溴脱氧尿嘧啶掺入法检测′）-。乙醇固定的细胞用200mu;g/ml RNase A在37°C染色20mu;g/ml PI。至于BrdU掺入法，我们遵循制造商的标记BrdU细胞增殖试剂盒说明书（BD生物科学pharmingen，San迭戈，CA）。10mu;M细胞BrdU 30 min，然后收获孵育，透性和所提供的试剂固定。300mu;g/mL DNase I用于尼克基因组DNA的小鼠FITC共轭抗BrdU抗体识别。PI或FITC染色细胞贝克曼Coulter流式细胞仪分析软件ModFit LT（真实的软件屋，托普瑟姆，我）

结果

激光陀螺和FISH分析表明YWHAZ份收益

染色体8q22.3代表独立获得地区在头颈部鳞癌、乳腺癌和前列腺癌，位于远从8q24.21扩增包括myc癌基因34-36。我们以前的分析发现2c13 RLGS片段染色体8q22.3在14出41个时序（~ 35%）在正常的7比较肿瘤组织。3d05 RLGS片段，相邻的片段2c13，显示类似的增强一致在大多数情况下2c13增强频率。两片段居YWHAZ 5′区域内，酪氨酸3 /色氨酸5（补充图S1）。该基因片段我们的RLGS接近和14-3-3蛋白的一般特点使YWHAZ顶级候选原癌基因。图1展示了YWHAZ基因及其邻近基因的位置。这里我们使用FISH分析审查确认DNA扩增状态（图1b，表2）。8号染色体多体是在33的48例患者检测。13有低水平（2 ~ YWHAZ / CEP8 = 4）和3的拷贝数增加的中间层（4 ~ YWHAZ / CEP8 = 10）。未出现高级别拷贝数增益（比例＞10）。相比之下，在8q24.21 MYC位点显示低水平的拷贝数增加10例，在5个拷贝数增加的中级水平和高级水平极拷贝数增加（MYC / CEP8＞20）1例（数据未显示）。对YWHAZ拷贝数变异是更好地描述为增益（低）而不是放大（高级）。总体而言，33%（16 / 48）的肿瘤样本进行了额外的YWHAZ拷贝的基因，通过分析确定的比例一致的激光陀螺。从激光陀螺和鱼的分析表明，低增益的YWHAZ基因在30-40%的头颈部鳞癌病例观察结果。

YWHAZ mRNA和蛋白在头颈部鳞癌患者样品中表达上调

要确定是否是一个经常上调YWHAZ基因在头颈部鳞癌，我们采用头颈部鳞癌组织样品的第二个独立的面板，采用半定量RT-PCR验证YWHAZ mRNA水平升高（图1C）。23表达了YWHAZ 44的肿瘤组织是调节（至少2倍以上的基础水平）相比，只有3的正常肝组织41（p值= 0.0024）。子分类的肿瘤位置表明YWHAZ mRNA水平均超过14 17 6 8舌和口腔肿瘤的2倍以上，但在10咽和喉肿瘤没有9只有3。这些数据是在头颈部鳞癌升高YWHAZ mRNA水平以前的报道相一致

对正常组织和肿瘤组织中的蛋白水平相同的TMA YWHAZ，设置用于FISH分析与YWHAZ抗体染色（图1D）。YWHAZ蛋白染色在细胞质中是无处不在的，更激烈的肿瘤比正常织。光在正常细胞内或周围是看似YWHAZ染色细胞核。一些增生和非典型增生的正常组织细胞也呈阳性YWHAZ。有趣的是，在肿瘤样本的pt91，YWHAZ拷贝数增益证实了鱼，在YWHAZ染色强度的正常和肿瘤样本之间没有差异。

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