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外文翻译 应化1302班 李陟鹏

芒草中三种木质纤维素特质在NaOH和H2SO4预处理下对生物质酶解率的影响

Wei Zhanga, Zili Yi , Jiangfeng Huang, Fengcheng Li , Bo Hao, Ming Li ,Shufen Hong, Yezi Lv , Wei Sun, Arthur Ragauskas , Fan Hu, Junhua Peng, Liangcai Peng

摘要

本次研究中，共探究了80种典型的芒草种类，其具有的不同木质纤维素特征，包括纤维素结晶度（CrI），聚合度（DP）和摩尔数（MN）。相关研究表明，纤维素结晶度和摩尔数以及纤维素聚合度说明了用三种浓度的NaOH或H ₂ SO ₄预处理对生物质酶解率有明显的负面影响。相比之下，两种具有相似纤维素含量的芒草样品的比较分析显示，纤维素聚合度和结晶纤维素摩尔数是糖化量的正影响因子，表明纤维素水平与三种纤维素特征之间的交叉效应。结果可以提供木质纤维素酶解机理的参考，并为生物能源作物遗传工程提供参考。

关键词：芒草 结晶指数（CrI） 聚合度（DP） 摩尔数（MN） 生物质酶解率

1. 简介

能源危机和全球变暖导致人们对可再生和可持续燃料的有着强烈的需求。木质纤维素是含量最丰富的生物质能源，是生物燃料和其他化学产品中碳的主要来源（Himmel等，2007）。过去几年来，为提高木质纤维素转化高生物能燃料的转化率，人们已经付出了很大的努力。然而，由于植物细胞壁的顽抗，木质纤维素转化高生物质能源的过程仍然是困难和昂贵的，其中包括三个主要步骤的：物理或化学预处理，酶降解和发酵过程（Ragauskas等人，2006）。因此，了解木质纤维素特征及其对生物质转化的影响对于生物能源产品的开发具有重要的科学意义（Reddy和Yang，2005）。

纤维素主要是葡萄糖分子通过糖苷键彼此连接的长链结构（Arioli等人，1998）。纤维素占主细胞壁干质量的30％，占次级细胞壁干高达40％（Fry，1988）。多糖的不同层之间的氢键和平行链之间的范德华力支撑着纤维素的晶体结构。纤维素结晶区域与无定形区域交替（Bansal等人，2010; Park等人，2010）。纤维素一个微纤维结构通常是由约36个氢键链接葡萄聚糖组成的不溶性缆状结构，每个葡萄聚糖有500到14,000个由beta;-1,4键链接的葡萄糖分子（Mohnen等，2008）。（Haigler，1987）已经提出了微纤维子结构的各种模型来解释天然纤维素中的无定形区域和结晶区域。

（Segal等，1959）已经使用结晶度指数（CrI）来描述纤维素中结晶物质的相对量。用于测定纤维素结晶度的技术包括X射线粉末衍射，固态C13核磁共振，密度测量和傅里叶变换拉曼光谱（Bansal等，2010）。相比无定形纤维素，高度结晶纤维素更难被纤维素酶攻击。因此，纤维素的结晶度不利于生物质酶水解效率（Chang和Holtzapple，2000; Laureano-Perez等，2005）。所以，在大多数研究中，研究人员利用相对纯的纤维素作为基准来确定结晶度和酶水解速率之间的相关性，这（相对纯的纤维素）不能代表从生物中预处理和酶水解后获得的含有杂质的木质纤维素。

聚合度（DP）也是生物质酶水解的重要特征（Yang 等，2011）。目前，两种技术通常用于测量纤维素DP，即粘度测定和凝胶渗透色谱法（GPC）方法（Hallac和Ragauskas，2011）。粘度测定技术在确定木质纤维素样品中更受欢迎（Kumar等，2009）。杨树和白杨分别具有3500和4500的纤维素聚合度DP（Hallac和Ragauskas，2011）。农业残留物的纤维素聚合度DP为1800至4000（Kumar等，2009）。几个报告表明，DP值与生物量消化率成反比。几个报告表明，聚合度DP值与生物量消化率成反比。由于纤维素链还原端数量的增加，纤维素聚合度DP的减少显著地改善了生物质酶水解（Pan等，2008; Puri，1984; Zhang和Lynd，2004）。然而，其他报道表明，聚合度DP并没有有效地、显著地影响木质纤维素水解（Sinitsyn等，1991）。

除结晶度指数CrI和聚合度DP之外，纤维素的摩尔数（MN）是除纤维素含量和聚合度两者的另一重要参数。原则上，纤维素摩尔数MN可以计算纤维素每单位长度/重量，即希纤维素的摩尔质量。然而，很少有人知道关于纤维素摩尔数MN对生物质酶解糖化的影响。此外，其他生物质结构特征也可能影响生物质酶消化率，如可接触的生物质表面积，生物质粒度和木质素和半纤维素的物理分布以及它们与纤维素的结合（Zhu等，2008）。在预处理期间也可能发生结构特征之间的交叉影响，并且一个结构特征的变化可能导致其他结构特征的变化（Hallac和Ragauskas，2011）。

芒草是一种典型的C4多年生草种，作为重要的的可持续能源作物具有巨大的潜力（Lewandowski等，2003）。芒草源自东亚；每个种类涵盖不同的生态和区域类型，芒草种质资源多样化，在以前的研究中收集了1400多种天然芒草种质 (Xie and Peng，2011; Huang等，2012)。为了探究生物质转化率与纤维素特征的关系，本研究分析了80种代表性的芒草种质。这些种质表现出多种的细胞壁组成，生物质酶解率和以CrI，DP和MN为特征的纤维素结构特征。然后在实验和统计分析中检测出纤维素CrI，DP和MN对芒草生物质分解的具有显著影响。

2.实验方法

2.1 物料

芒草样品选自2007年在中国收集芒草自然种质。在2009年收获芒草的季节从湖南实验田采集芒草样品的成熟茎组织在105℃下处理5分钟后，在50℃下干燥。干燥研磨后通过40目筛并储存在干燥容器中直至使用（Huang等人，2012; Xu等人，2012）。收集的样品来源于5-10个单独的成熟茎组织，并且在用于细胞壁分级和组合物分析，生物量预处理和酶水解之前将研磨的粉末充分混合，如下所述。

2.2 生物质转化率的测定

2.2.1物理和化学预处理

H₂SO₄预处理：分别在三份芒草粉末（0.5克）中加入10mL三种不同浓度（0.25％，1％，4％，v / v）的H₂SO₄溶液。将样品管密封并在高压釜（15psi）中121℃下中加热20分钟。然后，将样品以150rpm在50℃下振摇2小时，并以3000g离心5min。将剩余的沉淀用10mL蒸馏水洗涤三次，并将所有上清液合并，用于糖分析。收集剩余残留物用于酶水解，将仅加入10mL蒸馏水的样品管在50℃下摇动2h作为对照。所有的实验均以一式三份同时进行实验（Xu等，2012）。

NaOH预处理：分别在三份芒草粉末（0.5克）中加入10mL三种不同浓度（00.5％，1％，4％，w / v）的NaOH溶液。将样品管在50℃下以150rpm摇动2小时，并在3000g下离心5分钟。 剩余的沉淀用10mL蒸馏水洗涤三次，并以3000g离心5分钟。将剩余的沉淀用10mL蒸馏水洗涤三次，并将所有上清液合并，用于糖分析。收集剩余的残留物用于酶水解，将仅加入10mL蒸馏水的样品管在50℃下摇动2小时作为对照。所有的实验均以一式三份同时进行实验（Xu等，2012）。

2.2.2 酶水解

来自各种预处理的剩余残余物用10mL蒸馏水洗涤2次，并用10mL纤维素复合酶缓冲液（0.2M乙酸 - 乙酸钠，pH4.8）洗涤一次。将用H₂SO₄和NaOH预处理样品洗涤的残留物，以浓度为0.16％的浓度加入10mL（2g / L）混合纤维素酶（含有beta;-葡聚糖酶≧6times;10⁴U）和纤维素酶≧600U和木聚糖酶≧10*10⁴U 。在酶水解期间，样品在150rpm下50℃振荡48小时。在3000g离心10分钟后，收集上清液以确定酶水解释放的戊糖和己糖的量。用仅加入10mL反应缓冲液的样品在50℃下摇动48小时作为对照。 所有的实验均以一式三份同时进行实验（Xu等，2012）。

2.2.3 总己糖和戊糖的比色法测定

紫外可见分光光度计（V-1100D，上海上海MAPADA仪器有限公司）应用于总己糖和戊糖的分析。使用蒽/ H ₂ SO ₄法（Fry，1988）检测己糖，并通过苔黑酚/HCl方法测定戊糖（Dische，1962）。蒽来自Sigma-Aldrich Co.Ltd。，氯化铁和苔黑酚来自国药化学试剂有限公司。使用D-葡萄糖和D-木糖作为标准品（由国药化学试剂有限公司购买）分别得出己糖和戊糖的标准曲线。测定来自预处理和酶水解的上清液己糖和戊糖总糖产量。考虑到戊糖含量高，可以先通过蒽/ H₂SO₄法测己糖在620 nm处的吸光度确定己糖含量，再对于660nm处的戊糖读数进行最终的己糖计算。测定了一系列木糖浓度的吸光度，绘制了扣除通过GC-MS分析验证的标准曲线。所有的实验均以一式三份同时进行实验。

2.3 植物细胞壁的分离

对前人先前描述的植物细胞壁分离的方法进行了小的修改（Peng等人，2000；Xu等人，2012），如图1所示，S1。在这项研究中，以生物质粉末为原料。如图所示，S1，用磷酸盐缓冲液，氯仿-甲醇和DMSO萃取原料。将剩余的残余物悬浮在0.5％（w / v）草酸铵中，并在沸水浴中加热1小时，并将上清液合并为总果胶。将剩余的沉淀物悬浮在含有1.0mg / mL硼氢化钠的4M KOH中，在25℃下浸泡1小时，并将合并的上清液中和，透析并冻干为半纤维素。在100℃下，用乙酸 - 硝酸萃取定义为粗纤维素的非KOH可萃取残余物1小时，生成颗粒称为结晶纤维素。所有的实验均以一式三份同时进行实验。

2.4粗纤维素和结晶纤维素酶解率的测定

如图1所述获得的粗纤维素和结晶纤维素样品 S1分别用两种浓度（12U / mL和1200U / mL）的10mL混合纤维素酶处理。将样品在150rpm下在50℃振荡48小时。 每12小时收集上清液以确定戊糖和己糖产量。所有的实验均以一式三份同时进行实验。

2.5纤维素结晶度（CrI）的测定

X射线衍射（XRD）法如前文Xie等（2012）人所说，用于测定纤维素结晶度指数（CrI），使用Rigaku-D / MAX仪器（Uitima III，Japan）。将原生物质粉末放置在玻璃样品架上（35times;50times;5mm），并在平台条件下检测。并在10-45^o以0.0197^o/ s的速度扫描。使用200peak（I₂₀₀，theta; = 22.5^o）的强度和200和110peak之间的最小强度（I_am，theta; = 18.5^o）估计结晶度指数（CrI），如下所示：CrI = 100（I₂₀₀-I_am ）/ I₂₀₀（Segal等，1959）。I₂₀₀表示晶体和无定形材料，而I_am表示无定形材料。使用五个代表性样品一式三份,检测CrI。标准误差为plusmn;0.05〜0.15。

2.6纤维素聚合度（DP）的测定

通过粘度法测量聚合度（Puri，1984; Kumar and Kothari，1999），根据等式：DP^0.905 = 0. 75 [eta;]。式中[eta;]是溶液的特性粘度。所有实验使用Ubbelohde粘度计的条件为25plusmn;0.5℃、溶剂为三乙二胺氢氧化物（Cuen）。通过列出特性粘度和浓度的乘积的预定值的USP表（USP，2002）进行计算特性粘度。[eta;]C）,表示相对粘度（eta;）值在1.1和9.9之间的纤维素样品。eta;_rel，使用等式计算：eta;_rel= t/t₀，其中t和t0分别是纤维素溶液和Cuen（空白）溶剂的流出时间。所有的实验均以一式三份同时进行实验。

2.7 通过GPC测定纤维素DP

将纤维素样品（15mg）在40℃下真空干燥过夜，并分开置于装有搅拌棒的试管中。将无水吡啶（4.00mL）和苯基异氰酸酯（0.50mL）依次加入注射器。将试管用聚四氟乙烯内村的盖子盖住并置于70℃的油浴中搅拌48小时。加入甲醇（1.00mL）以除去剩余的苯基异氰酸酯。然后将每个试管的混合物倒入100mL甲醇/水溶液（7:3）中以促进衍生的纤维素的沉淀。通过离心机离心收集固体，并用甲醇/水（1*50mL）和水（2*50mL）洗涤纯化。将衍生的纤维素样品在40℃真空干燥过夜。在GPC分析之前，将衍生的纤维素样品溶解在THF（1mg / mL）中，通过0.45lm过滤器过滤并置于2mL自动进样器小瓶中。通过安捷伦GPC SECurity 1200系统分析纤维素三硬脂酸酯样品的分子量分布，该系统配有四个Waters Styragel柱（HR0.5，HR2，HR4，HR6），Agilent折射率（RI）检测器和Agilent UV检测器（270nm）。使用THF作为流动相（1.0mL / min），注射体积为30mu;L。使用基于分子量为1.2times;10 ³〜3.6times;10 ⁶ g / mol的12种聚苯乙烯标准物构建校准曲线。数据采集和处理使用Polymer Standards Service WinGPC Unity软件（Build6807）。通过软件、通用聚苯乙烯校准曲线计算数均分子量和重均分子量（Mn和Mw）。通过分析Mn和Mw，得到纤维素样品的数

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