淡水贫营养康斯坦茨湖的沉积物甲烷厌氧氧化研究外文翻译资料

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APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, July 2011, p. 4429–4436 Vol. 77, No. 13

0099-2240/11/$12.00 doi:10.1128/AEM.00340-11

Copyright copy; 2011, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.

淡水贫营养康斯坦茨湖的沉积物甲烷厌氧氧化研究

Jouml;rg S. Deutzmann and Bernhard Schink*

Fachbereich Biologie, Universitauml;t Konstanz, D-78457 Constance, Germany

Received 15 February 2011/Accepted 26 April 2011

据报道，包括淡水栖息地在内的各种环境，末端电子受体为硫酸盐的甲烷厌氧氧化（AOM）已被发现，而且最近发现富营养化淡水环境中甲烷氧化的电子受体是硝酸盐和亚硝酸盐。在含有不同的电子受体即硝酸盐、亚硝酸盐、硫酸盐或氧气的情况下，用淡水湖泊康斯坦茨的沉积物样品进行放射性示踪剂实验，以跟踪来自¹⁴CH₄的¹⁴CO₂，而没有添加硫酸盐的¹⁴CO₂形成可以忽略不计，硝酸盐的加入显著增加了¹⁴CO₂的形成，这表明AOM可能与反硝化作用耦合。尽管如此，反硝化型AOM速率仍然比甲烷有氧氧化速率至少低1个数量级。使用分子技术，可以推定反硝化甲烷菌属于pmoA和16S rRNA基因序列检测NC10门。这些发现表明，硫酸盐型AOM在湖泊沉积物中不显著。然而，AOM也可以与该淡水环境中的反硝化作用相结合，首次表明这可能是一个普遍的过程，对减少甲烷排放起着重要作用。

淡水湖甲烷排放量占甲烷总排放量的2％~10％^[1]，因此淡水湖是全球甲烷来源的重要组成部分^[24,56]。甲烷的主要来源是由甲烷古生物菌在缺氧环境中生产，其中缺乏替代的电子受体^[8]。由于沸腾或混合事件，一些甲烷从沉积物中消失^[5,9]，但当它们到达有氧生物带时，它们中的大部分被甲烷有氧氧化菌氧化^[17]。甲烷有氧氧化菌利用分子氧在单加氧酶反应中活化甲烷以裂解C-H键^[28]。甲烷厌氧氧化（AOM）是由甲烷厌氧古细菌（ANME）与硫酸盐还原菌协同合作进行 ^[3,19,20,57]。尽管目前还没有确定的培养物^[37,38]，宏基因组分析^[16,33]以及在催化AOM的微生物垫中发现丰富的甲基辅酶M还原酶 ^[32]，这表AOM在大多数情况下都是阻碍甲烷的生成。根据等式（1），AOM中的能量增益（根据吉布斯自由能的变化[Delta;G^。，]）接近ATP合成的理论最小值（Delta;G°= -20kJ·mol^-1）^[45]，这几乎无法在两个有机体共生合作提供底物。

CH₄ SO₄^2- H→ CO₂ HS^- 2H₂O，

Delta;G°= -21.3/kJ ·mol^-1CH₄ (1)

因此，这一过程优先在大于800米水深的海洋环境和高甲烷环境中观测到。最近报道称，AOM与铁和锰 ^[2]或腐殖还原相结合^[47]，但这些电子受体与AOM的结合，并且产生这些过程的微生物都是未知的。然而，与所提出的电子受体相结合的AOM的能量产率将大大高于硫酸根，从而使反应在较低的底物浓度下发生^[52]。根据等式（2）^[41]，AOM也可以与反硝化耦合：

3CH₄ 8NO₂^- 8H → 3CO₂ 4N₂ 10H₂O，

Delta;G°= -928 kJ· mol^-1CH₄ (2)

这个过程中不依赖与古细菌的共生合作^[13]，而是由附属于NC10门的细菌进行的，该门是迄今为止没有任何培养代表的门。迄今为止尚未获得这种类型的富集培养物^[14,23,41]，而宏基因组则由两种富集物组装而成。事实证明，反硝化NC10细菌通过NO从亚硝酸盐中产生氧气^[12]。因此，这种类型的甲烷氧化发生在缺氧环境中，但是甲烷氧化的难点是不会厌氧地进行，并且甲烷通过甲烷单加氧酶反应被氧化，如好氧甲烷氧化菌。宏基因组已经鉴定出来甲烷单加氧酶的基因簇并且积极地转录和翻译^[12]。

据报道硫酸盐型AOM主要在海洋环境中^[3,30,53]，淡水环境中AOM几乎没有，由于反应物的过渡区在空间上紧邻，所以在淡水环境中AOM可能经常被甲烷有氧氧化掩盖^[49]。据报道，湖泊Pluszlig;see是一个富营养化湖泊^[11]，稻田^[35]，泥炭地^[47]和垃圾填埋场^[15]。

表1.采样位置，采样日期和估计的最大初始甲烷氧化速率 康斯坦斯沉淀培养

据报道，反硝化型AOM主要发生在富营养化的生物环境如受污染的地下水^[48]和污泥^[25]。富集来自富营养化的运河、沟渠^[4]和混合接种物^[23]，但缺乏淡水样品中反硝化型AOM的测量。有关这一过程分布的一些迹象可能来源于从各种淡水栖息地获得的NC10细菌附属的16S rRNA基因序列^[14]。然而，在这个未培养的门中几乎没有关于甲烷分布的信息，并且16S rRNA基因序列的存在并不能解释该过程的存在。

在淡水康斯坦茨湖中，甲烷和氧气的浓度分布表明在该湖沉积物中可能存在甲烷厌氧氧化^[43]，但不能排除微氧化甲烷氧化和梯度的时间干扰。在本研究中，我们在该湖的沉积物中检查了AOM，测试硫酸盐，硝酸盐和亚硝酸盐作为AOM可能的电子受体，并通过分子方法寻找微生物。

材料和方法

沉积物采样：康斯坦茨湖的下部水域（Litoralgarten; 47°41N，9°12E）在水深2〜 3米（表1），采用内部直径为80毫米的塑料管的沉淀物芯^[51] 采取沉积物样品。在德国Wallhausen和Egg之间的康斯坦斯湖上游，深度为80至120米的区域采用相同的塑料管收集Profundal沉积物。在Mainau岛（47°42N，9°12E）前采集了用于构建克隆库的深部岩心。所有沉积物芯至少20厘米长。芯的下端用塞子封闭不能有气泡滞留，并且上部用螺帽盖子盖住，避免捕获水中上浮的气泡，以防止运输过程中沉淀物的重新悬浮。封闭的沉积物芯要避免碰撞的被运送到实验室。因此，为了不干扰所研究深度为1~4cm的沉积物，直到排除芯在缺氧环境中所研究的沉积层的有氧污染的可能性。用于放射性示踪剂实验的所有沉积物芯在2009年2月至2010年2月期间收集并且立即储存在4℃下，并且在取样后24小时内开始实验。

¹⁴CH₄的制备: 如前所述，Methanospirillum hungatei的培养物在淡水培养基中生长^[54]，并进行了一些修改^[34]，使用20mM HEPES缓冲液（pH 7.2）代替碳酸氢盐缓冲液。将H₂-CO ₂（80:20）加入0.5巴的超压。在生长可见后，氮气通过培养物鼓泡去除剩余的CO₂。 添加1:5（体积/体积）混合物的¹⁴CO₂和H₂，并且进一步向0.5巴的超压加入。1周后，将预混H₂-CO₂（80:20）加入到0.5巴的超压中。将气体转移到填充有1M氢氧化钠的20ml血清瓶中，在含有3M NaCl的淡水介质中减少连二亚硫酸盐（以降低气体在液体中的溶解度），同时一些移除液体以释放超压。然后用含有霍加拉特的注射器取出气体以除去微量的¹⁴CO^[18]，并如前所述再次注入20ml的血清瓶中以捕获¹⁴CO₂。再次转移后，储存示踪气体至进一步使用。所有的转移都使用带有预装的（N₂或He）单向塑料注射器和一个配有鲁尔锁定Teflon阀门。在所有液体中加入刃天青作为氧化还原指示剂。

放射性示踪剂实验。把沉积物芯放入到缺氧环境中，并且移除最上面的1cm用以忽略实验中的有氧沉积层。将相同位置和采样日期的1~3cm深度的1~3个沉积物芯中的沉积物混合，并用几毫升（最多为沉淀物体积的1/10）的淡水介质^[54]稀释来获得粘稠的沉淀泥浆，可以通过3ml或5ml塑料注射器转移。将浆液分成不同的处理，加入所需的电子受体（2mM NaNO₃，1.5mM NaNO₂或2mM NaSO₄）。储备溶液用新鲜的双蒸水制备，过滤灭菌，并反复通过真空/ N₂处理脱气，并添加连二亚硫酸钠来确保无氧。处理后的沉淀物用塑料注射器取3毫升转移到9毫升血清瓶中，用黑色丁基橡胶塞子封闭，并用铝卷边帽盖住。用纯N₂冲洗气体去除缺氧环境中存在的氢，然后将示踪剂加入手套箱中。示踪剂用纯净未标记的甲烷稀释，使甲烷添加量相当于每升浆液10mu;mol。注射示踪剂的活性为1times;106至2times;106dpm。所有样品都在模拟原位温度4°C的N₂冲洗塑料容器中孵育。孵育后，将样品用NaOH（0.5M终浓度）碱化并在室温下储存过夜。通过使用单个小瓶的测量来避免由于取样期间的氧气污染而导致的假阳性结果。用装有鲁尔锁定Teflon阀门的单向塑料注射器取出1毫升气体，用于¹⁴CH₄放射性和CH₄浓度测量。将样品用N₂鼓泡5分钟除去剩余的¹⁴CH₄，并且通过管和针将小瓶连接至装有2ml Carbosorb E吸收剂（Perkin Elmer）的三个5ml小瓶，如前所述^[58]。 每次使用肥皂水和向瓶中注入氮气，开始捕获CO₂之前，要检查系统的密封性。将浆液用37％HCl酸化直至不再有可见的气体形成，然后用氮气鼓泡将剩余的¹⁴CO₂冲入捕获溶液中。 加入等体积的混合物Permafluor E （Perkin Elmer），将各组分混合，并将小瓶在黑暗中过夜储存减少发光。样品在LS 6100IC闪烁计数器（Beckman）中分析。甲烷氧化速率是由起始值与实验最初几天观察到的¹⁴CO₂的最高值之间的CO₂的增加估计的。在所有实验中都测试了硝酸盐，环境空气和无添加电子受体对甲烷氧化的影响，在实验prof2和两个滨海沉积物中测试了亚硝酸盐的影响，并且在实验prof1和prof2中研究了添加硫酸盐的影响和沿岸沉积物。

用于测定¹⁴CH₄放射性的气体样品转移到装有7ml甲苯的9ml血清瓶中，在室温下温育过夜，转移到含有10ml LumaSafe Plus混合物（Perkin Elmer）的小瓶中，并如前所述进行分析。用已知的值^[59]来计算甲烷在甲苯中的溶解度。将另一份样品转移至含有3ml饱和盐溶液的9ml血清瓶中，倒置于-20℃直至确定甲烷浓度。如前所述^[40]，使用6000 Vega系列气相色谱仪（Carlo Erba Instruments）测定甲烷。用Merckoquant试纸（Merck）估算硝酸盐和亚硝酸盐，并且估计硝酸盐和亚硝酸盐完全消失的时间。

NC10细菌的分子检测。根据制造商的说明书，使用BioSavant快速制备仪器（Bio 101），

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