水产养殖环境中的磺胺与四环素类抗性细菌以及其抗性基因的发生趋势外文翻译资料

 2022-12-08 11:12

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水产养殖环境中的磺胺与四环素类抗性细菌以及其抗性基因的发生趋势

摘要

在中国北方天津对水产养殖环境中的磺胺和四环素抗性基因现状以及它们的污染范围进行了调查。抗药性细菌的存在被认定并在天津市6家水产养殖场检测了相应的抗生素抗性基因。磺胺类抗生素抗性基因是普遍存在的,而且在检测的各种抗性基因中它们的浓度最高(3.0*10-5〜3.3*10-4sul1/16S rDNA,2.0*10-4〜1.8*10-3sul2/16S rDNA)。这很可能是因为在这一领域使用磺胺类抗生素比使用四环素类抗生素更为普遍。在蜡状芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌,巨大芽孢杆菌和不动杆菌lwofii中分离检测出了至少两种基因(tetM,tetO,tetT,tetW,sul1和sul2),并且所有上述基因在芽孢杆菌进行了检测。这表明了这些区域中确实有抗性基因存在。sul1基因在打肠杆菌之间的基因转移(例如,肠球菌属)和原产细菌(例如,芽孢杆菌属)通过系统发育分析出。增加抗性基因对公众健康的风险的耐药致病菌(例如,不动杆菌属)在土著细菌中发现。总体来说,这是第一次通过分析耐抗生素细菌的种类并采用定性和定量的方法来研究在中国北方典型的水产养殖场在抗性基因的全面调查。

1.简介

抗生素已被广泛用于水产养殖中,治疗由各种水生生物细菌性病原体感染的病例,并用亚治疗剂量,以提高产量。频繁使用抗生素的结果导致在水产养殖动物和环境抗性细菌中施加选择压力(Akinbowale et al., 2006, 2007; Kim et al., 2004; Rysz and Alvarez, 2004; Zhou, 1995)。耐药菌的出现引起了公众对食物链中水产食品和公共卫生问题的忧虑。

磺胺和四环素已被广泛用于治疗水产养殖中的细菌和原生动物的感染,而这种做法导致了抗性基因在水环境中的变异。因此,磺胺和四环素的耐药性在水产养殖中已经是个普遍的问题(Alcaide et al., 2005; Dang et al., 2007; Hoa et al., 2008; Kim et al., 2004; Le et al., 2005; Penders and Stobberingh, 2008).。磺胺因为它的广泛使用、高排泄率、高溶解度和持久性,在环境中值得备受关注(Lamshoft et al., 2007)。即使没有选择压力,耐磺胺菌可在水环境中稳定残留5到10年。耐磺胺细菌比磺酰胺本身更持久的事实已被证实。我们以前的研究解决海河(天津)磺胺抗性基因(sul1,sul2)的现状。这些基因的检测最有可能是由于磺胺在动物饲料和鱼塘中的过度使用 (Luo et al., 2010)因此,它在解决该地区水产文化抗生素耐药性问题中有着非常重要的作用。

为规范使用抗生素,在欧洲,北美和拉丁美洲已经建立了对抗生素耐药性的一些监测方案(Boerlin et al., 2005)。然而,主要的水产养殖产量来自抗生素的使用有限或根本不存在监管指引的亚洲国家 (Howgate, 1998)。抗药性细菌和抗生素抗性基因已被证明出现在越南,泰国,中国,韩国和印度的水产养殖业中(Dang et al., 2007; Ghosh and Mandal, 2010; Hoa et al., 2008, 2011; Ishida et al., 2010; Kim et al., 2004; Tipmongkolsilp et al., 2010)。在泰国等东南亚国家的综合水产养殖行业可能会极大地促进抗生素耐药性的传播。(Petersen et al., 2002; Petersen and Dalsgaard, 2003)

以前的研究已经证明,耐抗生素的细菌在水产养殖中(Inglis et al., 1991, 1993)由于抗生素的引入和使用后盛行,并且可能加速的抗性基因和耐药菌的传播(Kemper, 2008)。一旦细菌获得的的抗性基因,它可能会在环境中存在相当长的时间,即使没有选择压力(Bean et al., 2005; Enne et al., 2001; Tamminen et al., 2011)。许多细菌已被报道为同时有几种抗生素抗性,能把抗性基因的决定因素转换到不同的环境微生物(Agerso and Petersen, 2007; Agerso and Sandvang, 2005)和人类病原体中(Furushita et al., 2003; Guglielmetti et al., 2009),这导致不利的人类健康影响。大多数以前的研究集中在细菌耐药特点隔离耐药菌和文化为基础的定性抗性基因。由于单培养方法是无法解释抗性基因在整个微生物生态系统频谱的患病率(Tamminenet al., 2011)。据我们所知,只有在芬兰最近的一项研究监测了在一个养鱼场沉积物中的抗性基因的数量(Tamminen et al., 2011)。为了全面了解抗性基因和窝藏它们的耐药菌,有必要在实地研究用的抗性基因定量抗性细菌的表征整合。

中国占全球水产养殖总产量的约71%,抗性基因已经受到越来越多的关注。有研究报告了抗生素耐药性和相应的抗性基因在内河、流域和养猪场中的存在。然而,很少有研究曾经集中在中国水产养殖,从海水养殖的最新报告的异常定性评估氯霉素和四环素抗性细菌和文化为基础的抗性基因没有量化的抗性(Dang et al., 2006b, 2007)。在中国农业部已发出某些四环素和磺胺类药物可作为水产养殖场(中国渔政新闻纸,2004)饲料添加剂管理条例,极有可能造成比其他国家更多的抗生素耐药。天津已经由于其区位优势观察其水产养殖业的大发展。畜牧业和养殖业占全市农业总产值的57%,而全国平均水平为30%。因此,在中国对水产养殖业中的抗生素抗性的调查很有必要,尤其在天津。

本研究的目的是调查中国北方天津市典型的水产养殖环境中磺酰胺和四环素抗性细菌的多样性并量化其抗性基因。实时PCR应用到量化的抗性基因污染。据我们所知,这是第一次调查和比较耐抗生素细菌的种类和量化在中国淡水养殖业中检测相关的抗性基因的研究。这次调查提供了关于抗生素的基线数据(磺酰胺和四环素)在中国水产养殖的耐药谱,肠和原产细菌之间sul1基因的基因转移通过电阻隔离和抗性基因测序的基础上,系统性分析所暗示。

2方法和材料

2.1样品采集

我们在天津津南等区选择六大养殖场作为2009年7月的采样地点。水样品用无菌瓶从取样点三次用水预洗涤收集。表面沉积物样品(0-1厘米)在使用抓斗采样场的剖面中点进行收集,然后在无菌塑料袋充分混合。水和沉淀物样品都储存在黑暗中,并带到实验室分析前在冰中储存。

2.2耐抗生素细菌的活菌计数

1克湿沉积物(或1毫升水样)由涡流充分悬浮于9mL的无菌生理盐水(0.85%),以及调制一个10倍连续稀释液。根据我们的初步实验中,稀释后的样品的100微升直接镀到营养肉汤加含0,50,100,或200毫克/毫升含磺胺甲基异恶唑的1.5%细菌培养琼脂或0,5,10,20毫克/毫升的含四环素的细菌培养琼脂。培养物在30摄氏度下培养72小时。进行重复计数,计算每克沉淀物(每毫升水)中菌落形成单位(CFU)。

2.3从分离培养提取DNA

为了检测在SMXr和TCr细菌的抗性基因,我们随机挑选一些从选择性培养基平板耐药细菌的单菌落。然后这个单菌落在5mL的LB液体培养基中在30℃,200rpm下培养16小时。细胞通过离心收获在12,000rpm离心2分钟,然后,萃取DNA。

2.4从沉积物样品提取DNA

根据生产商的方案使用土壤的DNA分离试剂盒从沉积物萃取DNA。提取率和该DNA的质量通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计进行验证。提取的DNA进一步纯化使用该DNA纯自旋试剂盒(剧烈生物,北京,中国),以最小化的PCR抑制。

2.5抗性基因和16S rRNA定性PCR

定性PCR测定来检测的ARG和16S rDNA的,并且每个基因的PCR产物在质粒,他们被用作阳性对照,并使用无菌水作为阴性对照克隆。含靶基因的质粒进一步用于制备实时PCR的标准产品。引物(表S1)和PCR过程的细节在列表中被称为SI部分。

2.6抗性鉴定菌株

该16S rDNA全被用一般引物PCR扩增。总体积为20毫升的16S PCR产物直接送到北京基因组研究所测序。DNA序列通过基本局部比对搜索工具在国家生物技术信息中心网站分析(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得,用于细菌的鉴定。

2.7抗性基因和16s rDNA的实时定量PCR

含抗性基因和16S rDNA的质粒作为阳性对照。如前所述生成对阳性对照校准标准曲线(Pei et al., 2006)。至于实时PCR的详情,请参阅SI部分。

2.8量化抗生素

5种抗生素(如磺胺嘧啶(SD),磺胺甲恶唑(SMX),磺胺氯哒嗪(SCP),土霉素(OTC)和四环素(TC))量化在我们以前的海河的研究说明,包括沉积物样品的预处理,固相萃取HPLCeMS/ MS分析(罗等,2010)

2.9系统性分析

该sul1基因与北京基因组研究所(BGI,中国北京)PCR产物进行测序。测序引物(sul1_Fs,sul1_Fa)示于表S1。该序列从核苷酸转化为DNAMAN软件(Waffleman,1994)的氨基酸,和序列比较是在CLUSTALX2.0进行(拉金等人,2007),并在VISSA修整 (Li and Godzik, 2006)。进化史是使用邻接法推断(Saitou and Nei, 1987)。树是按比例绘制,在同一单位用来推断系统发生树的进化距离分支的长度。进化距离用泊松校正方法(Zuckerkandl和鲍林,1965)计算,并在每个网站的氨基酸取代的数目的单元。系统发育分析在MEGA4进行了(Tamura等人,2007年)。

3.结果与讨论

3.1活菌计数和细菌耐药率

图1示出的电阻率(定义为上生长的抗生素平板细菌总数除以不含有抗生素的平板细菌总数),用于水和沉淀物样品在不同采样点。由于电阻(图一),沉积物中的培养细菌的总活菌计数均比水中的高。水样中的细菌在200毫克/毫升的SMXr板上没有菌落,这可能是因为沉淀物中的丰富的和分布比水中的高。

相比SMXr分离物,在TCr细菌中观察(图1)更低的筛选浓度(5,10,20毫克/毫升)和电阻率。这可以归因于在此研究中计算SMX(40.9毫克/毫升)和TC(2.1毫克/毫升)的EC 50值的发散。表S2显示了在所有采样位置磺酰胺浓度的总趋势比四环素的高。这反映该区域磺胺的使用量比四环素的高。由于它们的价格低,磺胺仍然在水产养殖和家禽养殖业中大量使用。在中国,添加到饲料的磺酰胺的允许量(60e100克/ 1000千克饲料)都比四环素的高很多(最多7.5克/ 1000kg饲料)(中国农业部,2001年)。这种差异可导致磺酰胺,而不是四环素的患病率,结果,磺胺在这一领域的耐药性比四环素的高。

图.1 C电阻率(定义为生长在抗生素板由细菌的总数生长在不含有抗生素的平板划分细菌数目)水样品中的细菌在不同浓度的抗生素,(A)的新诺明电阻率(B)磺胺甲恶唑的耐药率在沉积物样品(C),四环素耐药率沉积物样本。BC:北辰区的取样位置; DL:在东丽区的取样位置; NH1(NH2):采样点1(2)在天津市西青区; JN1(JN2):(2)在天津市津南区采样位置1。

Hoa等人在研究中观察到类似的抗生素污染。这表明了磺胺是在越南北部水环境中的主要污染物(2011)。然而,出乎我们的意料,在澳大利亚、荷兰等国家的水产养殖环境中通过比较它们的电阻率,发现磺胺类耐药性细菌比四环素类耐药性细菌多很多(Akinbowale et al., 2006; Penders and Stobberingh, 2008; Schmidt et al., 2000)。这些差异反映了抗生素在各地区和国家的使用是不一样的。

3.2耐抗生素细菌的鉴定

采用16S rDNA全分析,找出孤立的耐药细菌。水样中耐药细菌(只为SMX)和不同采样点的沉积物样品的物种组合物的结果总结在表1和2。因为基本培养的方法由于其对媒体和培养条件等的局限性给检测微生物带来一定的偏差,因此,在此研究中发现芽孢杆菌是从SMXr(总耐药菌的63.27%)和TCR(总耐药菌的57.14%)中获得的细菌中最占优势的抗性菌株。这一结果与越南虾池和鱼塘中最常见的SMX-耐药性细菌是不动杆菌的研究结果又不同(Hoa et al., 2008)。然而,在越南虾池的另一项研究发现弧菌是一种常见的SMX耐药细菌,其次为芽孢杆菌(Le et al., 2005)。这些结果可能反映了细菌群体的物种组成的地区差异。Le等人(2005)也指出,芽孢杆菌菌株产生的抗微生物化合物的存在可能有助于细菌耐药性的发生率很高的抗生素的研究。

此外,这项研究还显示,SMXr细菌TCR细菌不同。对于SMXr细菌,

Pseudochrobactrum(11.22%),微小杆菌(8.16%),产碱杆菌(6.12%),不动杆菌(4.08%),Rummeliibacillus(3.06%),短杆菌属(2.04%),和肠球菌(2.04%)被确定,而TCR细菌包括Sporosarcina aquimarina(16.07%),其次是virgibacillus(7.14%),Lysinibacillus(5.36%),不动杆菌(5.36%),Planomicrobium(3.57%)和类芽孢杆菌(3.57%)。在越南和澳大利亚水产养殖的设置,假交替单胞菌属菌,气单胞菌属,假单胞菌属,黄杆菌属,爱德华菌属和哈夫尼菌

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