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基于MMP-2的短肽基水凝胶对可控抗癌肽递送的合理设计

摘要：分子自组装通过初始分子设计可以利用先进材料的结构和性质。为了开发具有刺激响应性的短肽基水凝胶，我们通过将蛋白酶切割位点基序工程化为自组装肽序列来设计短两亲性肽。我们证明了设计的Ac-I3SLKG-NH2和AcI3SLGK-NH2自组装成纤维状水凝胶和Ac-I3SLKG-NH2）水凝胶显示出响应MMP-2的降解，但Ac-13SLGK-NH2水凝胶没有。发现Ac-13SLKG-NH2切割成Ac-13S和LKGNH2是酶促降解的机械原因。最后，当抗癌肽G（IIKK）3I-NH2（G3）被包埋到Ac-13SLKG-NH2水凝胶中时，其释放显示发生在“细胞-要求“在存在过量表达MMP-2的HeLa细胞的情况下，因此导致它们在凝胶上生长的显着抑制作用。

1.介绍

从基础科学和应用科学的角度来看，分子自组装具有特别重要的意义。对于实际应用，分子自组装的主要优点是通过简单的分子工程利用复杂材料的结构和性质的可行性。由于生物来源和明确定义的纳米结构，由肽和蛋白质自组装形成的合成材料在过去几十年中受到了极大的关注。特别地，自组装肽水凝胶已经广泛用于生物医学应用，例如组织工程，再生医学和药物递送，这是它们与天然细胞外基质（ECM）（例如，纳米纤维网络和微孔）的结构相似性的说明。结构），独特的性质（例如，极薄的含水量和稀释后的快速恢复），以及化学和生物装饰和功能化的简易性（例如，通过侧链和末端修饰和骨架合）。^1-7例如，来自RADA-16自组装的纳米纤维支架可以为轴突提供允许的环境，以再生甚至将脑组织编织在一起。⁸作为另一个例子，beta;-发夹肽的自组装水凝胶可用作局部姜黄素递送的注射剂。⁹

促进细胞-基质相互作用和引导细胞行为，将额外的生物活性信号纳入肽水凝胶是一种理想的策略。例如，在将功能性基序（例如，基于RGD的部分，层粘连蛋白衍生的序列和骨髓归巢肽）掺入RADA16肽中后，自组装纳米纤维支架已成功用于成年小鼠神经干细胞。三维文化¹⁰最近还有大脑组织工程。¹¹为了赋予具有受控降解特征的肽水凝胶，已将基质金属蛋白酶（MMP）-敏感底物掺入自组装肽序列中。^12-14众所周知，MMP通过ECM的降解和重塑以及来自ECM的生长因子和其他信号的调节释放在定义细胞行为中起关键作用。^15-17结果，这些肽水凝胶显示出对MMP的易感性，从而导致增强的细胞迁移和扩散。^12-14为了避免或减轻额外序列对肽自组装和凝胶形成的有害影响，待生物工程化的亲本肽通常含有超过¹⁵的残基，例如离子互补肽，^8,10,11多域肽，^13,18和beta;-发夹肽。^9,14

对于实际应用，短肽长度总是有利于大量销售和低成本生产。此外，短肽更稳定和稳健，并且相对于长多肽和大蛋白质，它们的结构-功能关系容易建立。^19,20由于这些原因，含有强凝胶能力和生物活性基序的短肽序列的开发仍然是一个挑战。异亮氨酸是一种疏水性氨基酸，具有很强的beta;-折叠结构倾向。²¹通过利用异亮氨酸的内在特征，我们设计了一种超短表面活性剂样肽Ac-I3K-NH2，具有很高的自组装能力。水溶液通过形成长而稳定的纳米纤维。^22,23此外，在疏水/亲水残基的界面处插入功能性半胱氨酸（C）或谷氨酰胺（Q）残基不仅对肽的自组装能力产生很小影响，而且赋予他们刺激反应能力。^24,25例如，Ac-I3QGK-NH2在转谷氨酰胺酶存在下经历了显着的溶胶-凝胶转变，因此用于快速止血。²⁵在Ac-I3K-NH2的基础上，结合MMP裂解基序的结构特征，我们在这里设计了一个短肽Ac-13SLKG-NH2。我们证明肽可以在水溶液中自组装成纤维状水凝胶，随后在变薄后显示出快速恢复特性。此外，自组装纳米纤维和缠结网络在用MMP-2处理后可以被显着破坏，导致Ac-13SLKG-NH2水凝胶的机械性能逐渐降低，因此表明对酶促切割的易感性。最后，何时将抗癌肽物理包埋在水凝胶中，其释放在HeLa细胞存在下以“细胞需要的”方式发生，并且可以显着抑制癌细胞的生长。

2.材料和方法

2.1.材料.用于肽合成的材料，包括Rink酰胺-MBHA树脂，保护氨基酸，脱保护，偶联，裂解试剂，乙酸酐和溶剂，购自GLBiochemLtd.（中国上海）和BoMaijieTechnology（北京，中国）。钙黄绿素乙酰氧基甲酯（钙黄绿素-AM），3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）和MMP-2得自Sigma（St.Louis，MO）。在使用前重新蒸馏哌啶，二氯甲烷（DCM）和N，N-二甲基甲酰胺（DMF），并按原样使用其它物质。在所有实验中使用的水通过MilliporeMilli-Q系统处理，电阻率为18.2MOmega;cm。

小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3和人宫颈癌HeLa细胞获自上海细胞生物学研究所的细胞库。将细胞在含有10％胎牛血清（FBS）的Iscoves改良的Dubelcco培养基（IMDM）中于37℃，5％CO2下培养。

2.2.肽合成和水凝胶制备.肽本研究中使用的CEMLiberty微波肽合成仪合成。肽合成和纯化的详细程序已在我们之前的工作中描述。22最终产品经过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）和反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析，表明其正确的序列和高纯度（gt;98％）。

将合成的肽以8mM的浓度溶解于25mMHepes（pH7.4）中。首先对肽溶液进行超声处理约30分钟然后转移到水浴中。在80℃温育2小时后，将它们取出并在室温下进一步温育24小时温度。观察到自支撑水凝胶在达到室温时迅速形成。

2.3.肽水凝胶降解.肽水凝胶如上制备的剪切稀释和快速恢复性能（见下文）。对于降解测定，通过移液管将1mL肽凝胶与10mu;LMMP-2（人，重组，CHO细胞）混合，其在测试缓冲液（25mMHepes，pH7.5,40mu;MZnSO4中活化。和20mMCaCl2），在凝胶中产生100ng/mL的最终MMP-2浓度。在37℃温育指定的时间后，对肽水凝胶进行仪器表征以确定其降解行为。

2.4.原子力显微镜（AFM）和透射电子显微镜（TEM）.AFM测量在商业NanoscopeIVaMultiModeAFM（数字仪器）上进行例如，SantaBarbara，CA）采用硅胶晶片作为基板的轻敲模式。用5％中性Decon90溶液清洗二氧化硅表面，然后在使用前用水充分冲洗。将10微升肽水凝胶移液到二氧化硅表面上，然后立即加入140mu;L水。后吸附~30秒，除去过量的溶液，用N2吹扫干燥基质表面。以1Hz的扫描速率和0°的扫描角度获取AFM高度图像（512times;512像素）。

在以120kV的加速电压操作的JEOLJEM-1400电子显微镜上获得TEM显微照片。对于负染色TEM测量，将一滴肽水凝胶吸移到一小块Parafilm上，然后使用300目铜网格放在凝胶上面。接触约5秒后，铜网格为用2％乙酸双氧铀水溶液负染2分钟，然后用滤纸除去过量的溶液。对于低温TEM（低温-TEM）测量，在受控环境玻璃化系统（CEVS）中制备样品。26,27将肽凝胶（~20mu;L）移液到涂有系带的TEM铜网上用滤纸，在网孔上留下薄膜。在-165℃下将薄膜迅速投入液态乙烷储存器中。将玻璃化样品储存在液氮中，然后转移用于TEM成像的样品架（Gatan626）-174℃。

2.5.圆二色（CD）光谱.CD光谱是使用薄石英池（光程长度：0.05mm）在BiologicMos-450/AF-CD分光光度计上记录。波长扫描在250至190nm下进行，步长为0.05nm。所呈现的CD信号是六次单独测量的平均值并表示为[theta;]（（degcm²dmol^-1）。

2.6.硫磺素T（ThT）结合试验.ThT储备液（5将25mMHepes中的mMThT与水凝胶以1：100的体积比混合，然后轻轻涡旋5分钟。然后，在室温下在HoribaJobinYvonFluoroMax-4分光荧光计上在2mm石英比色皿中收集460至550nm的ThT荧光发射光谱。激发波长设定为442nm，激发和发射狭缝为2nm。

2.7.流变.在25℃下在锥板模式下操作的ThermoScientificHaakeMARSIII模块化流变仪（锥角：2.0°，直径：34.995mm，截断：0.105mm）分析肽水凝胶的流变性质。首先进行1Hz下0.01-100％应变的动态应变扫

描，以确定线性粘弹性方案。25,28然后，动态频率扫描从0.01到以1％应变进行10Hz。对于凝胶剪切稀化和恢复测量，在加载凝胶后，首先进行动态时间扫描（1Hz和1％应变）30分钟，然后施加1000％应变2分钟，然后立即将应变减少至1％和另一个动态时间以1Hz扫描30分钟。这样的循环重复三次。

2.8.MALDI-TOFMS。

在BrukerMircoflexMALDI-TOF质谱仪上进行质量测量。在存在或不存在MMP-2的情况下孵育15天后，肽凝胶为冷冻干燥，然后将冻干粉末完全溶解在六氟异丙醇（HFIP）中。在室温下通过蒸发除去HFIP后，引入一定量的30％乙腈/水，产生8倍稀释的肽溶液。例如，在这种处理后，不含MMP2的肽水凝胶的肽浓度从8降至1mM。如下所示，还在用于HPLC分析的样品制备物中进行处理。目的是消除对聚合低聚物或具有低溶解度的降解产物的MS和HPLC结果可能的不利影响。然后，将新制备的肽溶液与饱和基质（4-羟基-alpha;-氰基肉桂酸）在30％乙腈/水中以等体积比混合。最后，将1mu;L混合物滴在抛光的钢样板上并立即风干，然后进行质量测量。之前已经给出了质量测量的仪器条件。28所呈现的每个MS谱是512个单独测量的积分。

图1.设计肽的分子结构和自组装纳米结构：（a-c）Ac-I3SLGK-NH2和（d-f）Ac-I3SLKG-NH2。（a，d）分子结构，（b，e）低温TEM图像和（c，f）高度AFM图像。（b）和（c）的插图表明自支持肽水凝胶的形成（引入罗丹明B以帮助在紫外光下可视化）。在25mMHepes（pH7.4）中将肽浓度固定在8mM。

2.9.RP-HPLC.为了评估由MMP-2诱导的肽水凝胶的降解程度，将它们在配备有XBridgeBEHC18柱（4.6mmtimes;150mm，5mu;m）的Waters2695AllianceHPLC系统上进行RP-HPLC分析。使用与上述质量表征相同的程序制备用于HPLC测量的样品。工具性的参数与我们之前的研究中描述的相同。25,28根据衬底峰面积的减少，降解肽水凝胶的比例随时间计算，表示为（A子-Ammp）/A子，其中A子和Ammp是底物峰面积在不存在和存在MMP-2的情况下。

2.10.G（IIKK）3I-NH2在肽水凝胶中的包封和释放.抗癌肽G（IIKK）3I-NH2（由G3表示）用作递送实验的药物。为了监测G3的释放，它首先用FITC标记，从而产生了缀合物FITC-G（IIKK）3I-NH2（FITC-G3）。然后，FITC-G3是用Ac-I3SLKG-NH2或Ac-13SLGK-NH2精确称量并溶解于1mL25mMHepes（pH7.4）中，得到的肽溶液具有FITC-G3和AcI3SLKG-NH2或Ac-I3SLGK-NH2浓度分别为50mu;M和8mM。超声处理约30分钟后，在水浴（80℃）中孵育2小时在黑暗中，立即将肽溶液转移到24孔组织培养聚苯乙烯（TCPS）板的孔中，然后在室温下进一步温育24小时。对于响应于MMP-2的递送实验，在室温下孵育24小时后通过移液将酶与肽凝胶混合。最后，加入1mL的25mMHepes（pH7.4）凝胶表面。在37℃温育指定的时间后，除去缓冲液以通过荧光测量确定FITC-G3浓度。除去缓冲液后，立即向孔中加入1mL新鲜的Hepes缓冲液。使用HoribaJobinYvonFluoroMax-4分光荧光计测定25mMHepes（pH7.4）中FITC-G3的标准曲线及其在释放样品中的浓度。在490nm（激发狭缝=2nm）的激发下记录514nm处的发射荧光强度（发射狭缝=2nm）。基于该等式计算FITC-G3与肽水凝胶的释放比

释放率=Sigma;_iⁿC_iV_i/c₀V₀

图2.（a）存在和不存在MMP-2时肽水凝胶的储存模量（G）和（b）CD光谱。（c）在Hepes中和在肽水凝胶存在下~0.05mMThT的荧光发射光谱（在442nm激发）。将肽以8mM的浓度溶解在25mMHepes（pH7.4）中以形成水凝胶。在不存在和存在MMP-2的情况下在37℃温育15天后，在25℃或室温下对水凝胶进行流变学，CD和ThT结合测量。

其中c_i表示从孔中取出的第i上清液中的FITC-G3浓度，V_i是其体积，在我们的实验中为1mL;c₀表示凝胶中FITC-G3的初始浓度（50mu;M），V₀是孔中的凝胶体积（1mL）。

2.11．MTT测定和荧光显微镜.根据上述程序，在48孔TCPS板的孔中制备Ac-I3SLGK-NH2和Ac-I3SLKG-NH2水凝胶（100mu;L）。然后，将NIH3T3细胞（5times;105细胞/mL，150mu;L）分别引入含有和不含凝胶的

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