LeSPL-CNR通过抑制硝酸还原酶途径产生的NO负调控番茄对Cd的吸收

原文作者 Wei Wei Chen, Jian Feng Jin, He Qiang Lou, Li Liu, Leon V. Kochian, Jian Li Yang.

摘要：

主要总结了一种SPL类型的转录因子LeSPL-CNR通过调控 SlNR 表达和硝酸还原酶活性来抑制NO的产生，从而提高番茄的Cd耐受性。

镉（Cd）是一种剧毒污染物。确定影响植物体镉积累的的因素是减少人体从膳食中吸收镉元素的先决条件。在这里，我们汇报了 SQUAMOSA 启动子结合蛋白样（SPL）转录因子LeSPL-CNR参与调控番茄(Solanum lycopersicum)的镉耐受性。与番茄野生型AC相比，缺色不成熟表观突变体（Cnr）表现出对镉更高的积累以及对镉毒害的敏感性增强，这与LeSPL-CNR 的抑制作用是相符合的。硝酸还原酶（NR）抑制剂能够抑制Cd胁迫诱导产生的NO，而NO合成酶抑制剂不能抑制NO的产生。LeSPL-CNR 负调控SlNR 的表达和NR的活性。我们也证明了LeSPL-CNR 能够结合SlNR的启动子序列并抑制生物体内SlNR 启动子的活性，但不包括已知的SBP结合基序。另外，镉胁迫下，铁转运控制子SlIRT1在Cnr根系中的表达要明显高于AC。因此，LeSPL-CNR可能提供了一种将响应镉胁迫与依赖NR途径调控NO产生联系起来的分子机制，并促进番茄通过SlIRT1的表达对镉的吸收。

关键词：镉毒害；铁吸收；番茄；转录因子

引言

镉(Cd)对大多数植物、动物和人体来说是重金属剧毒物 (卢克斯等. 2011)。 然而,由于工业的快速发展和农药的使用镉污染物广泛地分布在土壤和水体中。因具有高度的可溶解性，镉能被植物轻易的吸收，通过食物链进入人体 ，进而危害人体健康 (上野等. 2010)。因此, 研究降低生长在镉污染土壤的作物的镉积累的方法从而保障人类健康是当今许多科学家的一项迫切任务。对植物响应镉毒害的基本认识是确保上述工作成功执行的先决条件。

许多植物生理过程已被证实参与降低镉毒害。一旦暴露在镉环境中，植物的根部会分泌螯合物到根部外围与Cd² 结合，降低其生物利用率。(朱等. 2011; 郭等. 2017), 同时，抑制Cd² 运载体的表达，尽可能减少进入根部细胞的Cd (毛等. 2014; 范等. 2014; 何等. 2017), 在细胞膜处将Cd泵出(金姆等. 2007), 并将Cd固定在质外体处(Krzeslowska 2011). 镉一旦进入细胞质，就会和各种硫羟化合物结合，例如谷胱甘肽、植物络合素以及金属硫蛋白 (DalCorso等. 2008), 也能够游离在液泡中(卢克斯等. 2011). 当Cd超积累的时候，植物会上调抗氧化机制来抵抗Cd诱导的氧化应激反应(Verbruggen等. 2009). 最近的研究表明，上述的许多反应都是受到转录因子(TFs)的转录调控所起始的。小麦中的高饱和脂肪酸4a是类A4物质热击转录因子得到的，其通过上调金属硫蛋白基因的表达来调控Cd耐受性(Shim等. 2009); BjCdR15是芥菜中的一种亮氨酸拉链转录因子 ，它可能通过上调植物体内几种金属转运蛋白基因的表达来增强Cd耐受性和Cd的积累(Farinati等. 2010);拟南芥中的一种锌指结构转录因子ZAT6通过控制GSH1的表达正向调控Cd耐受性 (陈等. 2016)。 然而, 转录因子是如何调控镉毒害的仍需要更进一步的研究,因为Cd能够在不同植物品种中影响许多转录因子的表达 (韦博等. 2006; 罗梅罗·普埃尔塔斯等. 2007; 塔马斯等. 2008).

SQUAMOSA启动子结合蛋白样（SPL）转录因子家族参与了植物生长发育和新陈代谢过程的各个方面(陈等. 2010b; 郭等. 2011; 普雷斯顿和 张绍2013)。最近,SPL蛋白在植物生物和非生物胁迫中所扮演的角色也逐渐清晰了。例如，据报道AtSPL14参与调控对伏马菌素B1（一种真菌毒素）的敏感性（Stone等，2005）。 AtSPL7能促进miRNA398表达，进而下调Cu / Zn SOD和叶绿体基质SOD的表达（Kliebenstein等.1998; Sunkar等.2006; Yamasaki等.2007; Abdel-Ghany和 Pilon 2008）。 全基因组测序分析显示AtSPL7调节FRO4和FRO5表达，这是将Cu（II）还原为Cu（I）所必需的（Bernal等.2012）。AtSPL7也被证明可以靶标铜转运蛋白COPT6，从而调控铜缺乏时的铜吸收（Jung等.2012）。 最近，雷等人. （2015）报道AtSPL3参与调控拟南芥的磷缺乏反应。 这些结果促使我们研究SPL蛋白是否也参与植物响应Cd毒害。在本研究中，我们利用番茄来研究LeSPL-CNR的作用，这是一种表观SPL蛋白，用于控制果实的成熟（Thompson等. 1999; Manning等. 2006），也能调节对Cd的积累和耐受性。 我们首次发现，LeSPL-CNR作为转录抑制因子，起到抑制硝酸还原酶（NR）表达的作用，并通过NR途径控制NO的产生; 从而抑制LeIRT1诱导的根部对Cd的吸收。

材料与方法

植物材料和生长条件

番茄（Solanum lycopersicum）栽培品种Ailsa Craig（AC）和无色不可成熟突变体（Cnr）（AC作为对照）与陈等（2015a）中描述的相同。将种子用10％ NaClO（v / v）消毒15分钟，并用无菌水彻底洗涤以除去残留的NaClO。然后将种子浸泡在无菌水里，置于200-rpm的摇床中过夜培养，之后转移到含有 1/5 浓度的改良 Hoagland 营养液和1％琼脂（pH 5.5，含10-mM Mes）的培养皿中发芽培养。营养液含有以mM为单位的常量元素：KNO₃, 1.0; Ca（NO₃）₂, 1.0; MgSO₄，0.4; NH₄H₂PO₄, 0.01和以mu;M为单位的微量元素：NaFeEDTA，20; H₃BO₃, 3.0; MnCl₂, 0.5; CuSO₄， 0.2; ZnSO₄， 0.4; （NH₄）₆Mo₇O₂₄, 1.0。发芽后，让幼苗在平板里培养2天，直到主根3-4cm长左右。然后将长势一致的幼苗转移到有孔的塑料浮漂板上，在1/5浓度的改良Hoagland营养液中预培养2天。通过加入不同浓度的CdCl₂到营养液中，来进行Cd处理。对药理学实验来说，不管是50mu;M的S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO），Chen等（2010a）。 100-mu;M硝普钠（SNP; Sangon，中国上海），20-mu;M 钨酸盐（Sangon），100-mu;M 2-（4-羧基苯）-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-羟基 - 3-氧（cPTIO; Dojin Laboratories）还是100-mu;M N ^omega;-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐（L-NAME; Sigma）都被加入处理溶液中试验过。培养液隔天更换。所有实验均在环境控制生长室中进行，白天 16小时/ 26℃，黑暗 8小时/ 23℃，光照强度为250-300 mu;mol 辐射光子 m^-2 s^-1 ，相对湿度为70％。

根伸长量情况和Cd含量测定

用尺子测量处理前后主根长度来评价根的生长情况，其中每组10个幼苗，重复至少两次。 对于Cd含量的测定，每五个植株合并为一个样品，处理后将植株分成地上和地下部分。 地下部分样品用1mM EDTANa₂ 溶液洗涤两次以除去根表面残留的Cd² ，同时将地上部分样品在去离子水中漂洗并吸干，并在60℃下干燥3天。 将干燥的组织称重并消化以通过电感耦合等离子体原子发射光谱法（AIRIS / AP，TJA，Thermo Fisher Scientific）测量元素浓度。

RNA提取和定量实时RT-PCR

如先前所述（Chen等，2015b）进行总RNA提取和实时定量RT-PCR，其中引物序列在表S1中提供。 番茄GAPDH，ACTIN和18S rRNA用作对照以标准化靶基因的相对表达。 使用Delta;循环阈值方法计算基因表达水平。

NO的测定

使用4-氨基-5甲氨基2，7-二荧光素二乙酸酯（DAF-FM DA）标记NO。 Cd处理后，用去离子水轻轻冲洗根部，根尖在含有10-mu;M DAF-FM DA的20-mM Hepes / NaOH缓冲液（pH 7.4）中反应30分钟进行探针的装载 。 在缓冲液中洗涤三次后，在显微镜下观察荧光现象（Nikon Eclipse E600，Nikon，激发波长488nm，发射波长495-575nm）。 在荧光显微镜下观察期间始终保持曝光设定为1秒。 通过Photoshop软件（奥多比系统）量化图像中绿色荧光的信号强度。

NR 活性的测定

NR活性的测定参照Jin等（2011）。 简言之，切下整个根并置于不同的试管中。 每管中加入5mL含有2％1-丙醇，100-mM KH₂PO₄（pH 7.5）和30-mM KNO₃的试液。 令样品在真空中渗透吸收5分钟，然后在暗室中，25℃水浴振荡反应30分钟。 反应后，从每个样品中取1mL转移到一支新的试管中，然后加入1mL磺胺（1％w / v，1.5M HCl）和1mL N-（1-萘基）- 乙二胺二盐酸盐（0.02% w/v ， 0.2 M HCl）。 样品在室温下反应30分钟。 用分光光度计测量540nm处的吸光度。

酵母单杂交实验

酵母单杂交实验的做法与我们之前的报告中提到的一样（范等，2015）。 为了研究LeSPL-CNR和SlNR启动子之间的相互作用，我们通过PCR技术从番茄基因组DNA中扩增了SlNR的启动子区段（表S1）。 将扩增得到的启动子区域克隆到pAbAi载体中的Aureobasidin A（AbA）抗性报告基因（AUR1-C）的上游。 在pGADT7（pAD-LeSPL-CNR）中的酵母转录因子GAL4的转录激活结构域之后，将LeSPL-CNR的开放阅读框架克隆到该框架中。 将这些质粒中的两种，pAbAi-ProSlNR和pAD-LeSPL-CNR，或阳性对照p53-AbAi和pAD-p53引入酵母菌株Y1HGold中，并在不含Ura但含有0或150 ng mL^-1 AbA的SD培养基上30°C培养3天，具体参照制造商的说明。

酵母中的反式激活电位检测实验

用特异性引物扩增LeSPL-CNR片段来获得全长LeSPL-CNR，其中NdeI和SalI限制性消化位点侧接每个全长/截短序列的两个末端（表S1）。 扩增的序列插入到pGBKT7（Clontech）的相应位点。 将每个质粒（和载体对照）分别转化到酵母菌株AH109（携带GAL4敏感的GAL1启动子和HIS3报告基因）中，并在SD-Trp或SD-Trp-His培养基上于30℃ 培养3天，具体参照供应商的说明。

本氏烟草叶片中的转录抑制实验

将全长LeSPL-CNR扩增并克隆到CaMV 35S启动子控制下的二元载体（pCambia2300）中。 使用特异性引物扩增SlNR的2-或1406-kb启动子（表S1）。 对于双荧光素酶测定，将2-kb启动子序列连接到报告载体pGreenII0800-LUC中（Hellens等. 2005）。 将报告质粒和效应质粒分别转化到根癌农杆菌GV3101中。 将携带报告质粒的100mu;L土壤杆菌和携带35S：LeSPL-CNR的900mu;L土壤杆菌共同转化到烟草叶中。 使用双荧光素酶测定试剂盒（Promega）测量萤火虫和海肾荧光素酶活性。使用美国VWR多功能荧光酶标仪（赛默飞世尔提供）进行分析。 对于绿色荧光蛋白报告基因检测，将启动子序列克隆到pCAMBIA1300载体中。 将一对质粒转化到农杆菌菌株GV3101中。 将重悬于浸润缓冲液（10-mM MgCl₂, 0.2-mM乙酰丁香酮，和10-mM Mes，pH 5.6）中的农杆菌细胞

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