证明促分裂原活化蛋白激酶20在番茄雄配子发生的单核向双核转变中发挥关键作用外文翻译资料

证明促分裂原活化蛋白激酶20在番茄雄配子发生的单核向双核转变中发挥关键作用

原文作者 Lifei Chen ¹ , Dandan Yang ¹ , Youwei Zhang ¹ , Limin Wu ² , Yaoyao Zhang ¹ , Lei Ye ¹ , Changtian Pan ¹ , Yanjun He ¹ , Li Huang ¹ , Yong-Ling Ruan ² and Gang Lu ^1,3

单位¹ Key Laboratory of Horticultural Plant Growth, Development and Biotechnology, Agricultural Ministry of China, Department of Horticulture, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China;

² Australia-China Research Centre for Crop Improvement and School of Environmental amp; Life Sciences, The University of Newcastle, Callaghan, NSW 2308, Australia;

³ Zhejiang Provincial Key Laboratory of Horticultural Plant Integrative Biology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

摘要：

• 促分裂原活化蛋白激酶家族蛋白(MAPKs)可在多方面参与调节植物生长。然而，它们在生殖发育中的潜在作用仍不清楚。
• 本研究发现了一个植物特异性的MAPK D亚组蛋白SlMPK20，并揭示其在番茄花粉发育中的独特作用。利用RNAi介导的基因沉默技术抑制SlMPK20基因表达或使用CRISPR/Cas9将其敲除均可以显著降低或完全消除花粉活力，而对雌性育性没有影响。细胞生物学和基因表达分析证实SlMPK20在雄配子发生的单核向双核转变过程中发挥特殊作用。这一论断基于发现转基因花粉在双核期大量败育，单核小孢子期中期出现亚细胞结构异常；SlMPK20 mRNA和SlMPK20-GUS信号定位于四分体、单核小孢子和双核花粉粒中，而不是在小孢子母细胞或成熟花粉粒中。
• 转录组学和蛋白组学分析表明，SlMPK20的敲除显著降低了大量控制花药中糖和生长素代谢及信号转导相关基因的表达。最后，通过蛋白-蛋白互作试验，推定SlMYB32为SlMPK20的靶蛋白。
• 本研究得出SlMPK20通过调节糖和生长素代谢及信号转导，特异性调控减数分裂后花粉发育的结论。

关键词：雄配子发生；促分裂原活化蛋白激酶；花粉发育；番茄；糖和生长素

1.引言

花粉发育是植物有性生殖的关键，它涉及三个阶段：小孢子发生、雄配子发生和花粉成熟(McCormick，1993；Durbarry等，2005；Wilson和Zhang，2009)。在小孢子发生过程中，小孢子母细胞经过两轮减数分裂后产生四分体，然后发育成四个游离小孢子。雄配子发生被定义为减数分裂后的花粉发育，期间产生花粉粒，每个花粉粒通过两轮有丝分裂产生一个营养核和两个精子(McCormick，2004)。

大量的基因涉及花粉发育的各个方面，特别是小孢子发生。例如，转录因子DYT1和TDF1分别调控花粉母细胞中早期绒毡层的功能(Zhang等，2006；Feng等，2012)和在减数分裂过程中绒毡层的分化(Zhu等，2008)。DYT1互作蛋白bHLH010、bHLH089和bHLH091在控制绒毡层正常形态和胼胝体降解方面冗余（Zhu等，2015；Cui等，2016），而调控级联TIP2-TDR-EAT1则控制水稻的绒毡层细胞程序性死亡（PCD）（Li等，2006；Niu等，2013； Fu等，2014）。转录级联DYT1-TDF1-AMS-bHLH89/91-MYB80在拟南芥、水稻和番茄中是保守的（Phan等，2011；Jeong等，2014；Ferguson等，2017）。

与大量关于小孢子发生的分子调控的知识相比，我们对于雄配子发生调控的了解仍然有限且零散。在此背景下，以往的研究大多数集中在花粉内壁形成、离子转运、碳水化合物代谢和细胞周期调节相关基因的鉴定。例如，抑制FLA3，一种类成束状阿拉伯半乳聚糖蛋白，会影响花粉内壁形成（Li等，2010）。镁转运蛋白AtMGT4的突变导致双核期花粉败育（Li等，2015）。SET DOMAIN GROUP2（SDG2）介导的H3K4me3在配子有丝分裂细胞周期进程中发挥作用（Pinon等，2017）。新的证据也指明，糖代谢和茉莉酸（JA）在花粉成熟中起重要作用（Song等，2013；Wang和Ruan，2016）。然而，控制减数分裂后花粉发育的上游分子组分仍不清楚。

促分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）在调控多种信号转导途径中发挥重要作用。MAPK级联途径由三种连续的激酶组成：MAPK、MAPK激酶(MAPKK)和MAPKK激酶(MAPKKK)。MAPKs通常磷酸化转录因子，激活相关信号通路，进一步调节下游基因的表达（Group等，2002；Hao等，2015）。系统进化树分析发现，MAPKs可分为四个亚组。其中，A、B和C亚组都有“TEY”基序，存在于动物和植物中，而D亚组是植物特有的，包含“TDY”基序（Mohanta等2015）。

含TEY基序的MAPKs在不同植物中被广泛研究。其中，A亚组和B亚组MAPKs参与胁迫响应和生长发育的其他方面（如：Rohila和Yang，2007；Lee等，2011；Li等，2013）。据报道，一些TEY MAPKs包括AtMPK3/6（Hord等，2008）、AtMPK4（Zeng等，2011）和AtMPK4的一个同源物SlMAPK7（Chen等，2016），在绒毡层和花粉早期发育中起重要作用。相比之下，我们对植物特异性TDY MAPKs作用的认识仍处于初级阶段，近期只有一份研究显示，TDY MAPK的PrMPK9在花粉-雌蕊互作中的作用（Chai等，2017）。没有直接证据表明任何植物特异性TDY MAPKs参与花粉发育。

本研究报道了D亚组MAPK SLMPK20在番茄减数分裂后花粉发育中的特殊作用。实验证明了SlMPK20的抑制或敲除导致雄性不育。我们认为，SlMPK20对中晚期单核小孢子发育具有正向调节作用。RNA-seq技术和蛋白质组学分析显示，SlMPK20可能通过糖和生长素代谢和信号传导相关基因调控网络来控制减数分裂后花粉的发育。总之，这项实验对研究SlMPK20在减数分裂后花粉发育中的特殊作用作出了前所未有的贡献。

2. 材料及方法

2.1 植物材料及生长条件

番茄Micro-Tom(Solacum lycopersicum L. cv Micro-Tom)参照Chen等（2016）所报道的方法进行播种和培养。

2.2 qRT-PCR分析

用PrimeScript^TM RT试剂盒(Takara,Kusatsu,Japan)提取总RNA合成cDNAs。采用SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Takara)和序列特异性引物（依据信息表S1）进行定量反转录聚合酶链反应，Ubi3 (GenBank登录号：X58253)作为内参基因(Kong等，2012)。经3次生物学重复，采用法，计算目的基因的相对表达水平。选取Delta;Ct最高的样品作为标准样本(Livak amp; Schmittgen，2001)。数据采用SPSS分析(v.22.0；IBM，Armonk，NY，USA)。采用双侧t检验进行统计分析。

2.3 原位杂交和亚细胞定位实验

原位杂交方法参照Wang和Ruan报道的方法（2016）。使用引物对Yw-SlMPK20-F/Yw-SlMPK20-R（表S1）构建SlMPK20特异性探针模板。

对于SLMPK20的亚细胞定位，使用引物对SlMPK20-YFP-F/SlMPK20-YFP-R（表S1）对其编码序列进行PCR扩增，然后克隆到pB7WGY2载体（Karimi等，2002）中，通过Gatewayreg;技术（Invitrogen）产生pB7WGY2-SlMPK20-eYFP。同样，使用引物对SlMYB32-GFP-F/SlMYB32-GFP-R（表S1）对SlMYB32的全长编码序列进行PCR扩增，然后融合到修饰后的pFGC5941载体pAC402中（来自美国普渡大学Dr Zhixiang Chen），产生pFGC-SlMYB32-GFP。将转化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）渗入到6周的野生型（WT）本氏烟草（Nicotiana benthamiana）的叶片（Liu等，2009）。入渗后36 h，用共聚焦显微镜（Zeiss LSM 780，Germany）检测叶片细胞发出的黄色或绿色荧光蛋白（YFP或GFP）荧光。

2.4 SlMPK20Pro-GUS构建及GUS染色

使用引物对Pro-SlMPK20-F/Pro-SlMPK20-R（表S1）惊醒PCR扩增SlMPK20翻译起始位点ATG上游的一个1964 bp的5rsquo;非编码区域，并克隆至pBI121载体中，使之与beta;-葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因融合。利用标准的浸花法将其转化至拟南芥植株（Bent和Clough，1998）。组织化学GUS实验检测参照Wang和Ruan（2016）的方法。

2.5 融合蛋白表达及免疫印迹分析

用基因特异性引物对Yh-SlMPK20-F/Yh-SlMPK20-R（表S1）将SlMPK20的编码序列克隆到pET32a( )载体中。重组载体转化大肠杆菌菌株BL21（DE3），在30℃下使融合蛋白的表达。利用镍柱（GeneScript，Nanjing，China）纯化His标签融合蛋白。所有融合蛋白均采用超滤管浓缩（Millipore，Bedford，MA，USA）。

为了进行免疫印迹分析，将雄蕊样品在液氮中研磨，取600mu;L缓冲液提取蛋白质，缓冲液中含有100 mM HEPES（pH7.5）、5 mM EDTA、5 mM EGTA、10 mM Na₃VO₄、10 mM NaF、50 mM beta;-甘油磷酸酯、1 mM苯甲基磺酰氟、10% v/v甘油、7.5% w/v聚乙烯聚吡咯烷酮和10 mM DTT。样品在4℃下13000 g离心20分钟，在10% SDS-PAGE凝胶上分离上清液中的蛋白质，转移到硝酸纤维素膜上，用SlMPK20中KQERSVETERDMNC的C端序列制成的兔抗anti-SlMPK20多克隆抗体（GeneScript，Nanjing，China）进行检测。

2.6 RNAi和CRISPR-Cas9载体的构建及转化

设计了一种SlMPK20 RNAi载体，其中发夹形状的SlMPK20 mRNA片段的转录由花粉特异性启动子LAT52启动（McCormick，1993）。根据Pan等人（2016）的方法，利用CRISPR-Cas9技术构建SlMPK20敲除载体（详见方法S1）。

2.7 PCR检测及RNA-seq 分析

对于SlMPK20 RNAi株系，用引物RNAi-JC-F/RNAi-JC-P2-R对阳性植株进行PCR检测（表S1）。通过对SlMPK20特异性引物CRISPR-SlMPK20JC-U2/CRISPR-SlMPK20JC-D扩增出来的PCR产物测序，检测SlMPK20敲除效果（表S1）。

在特定阶段用RNA试剂盒（Omega）从雄蕊中提取总RNA。根据Ru等（2017；详见 S2）的研究，RNA测序由百迈客生物科技有限公司（Beijing，China）进行。

2.8 花粉形态分析及电子显微镜观察

根据Wang等（2008）的研究，采用荧光素双醋酸酯染色法测定花粉活力。根据Song等（1999）的研究，对花粉萌发进行了测定。根据Wang和Ruan（2016）的研究，采用TUNEL （脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法）方法对小孢子核进行4rsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色（Regan和Moffatt，1990）。扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）的使用如Lin等（2014）所述（详见方法S3）。

2.9 酵母双杂交实验

利用引物对BD-SlMPK20-F/BD-SlMPK20-R（表S1）扩增SlMPK20的编码序列，克隆到pGBKT7载体中GAL4结合域近端。根据说明书（Clontech，Mountain View，CA，USA），以BD-SlMPK20为靶标对番茄cDNA文库进行筛选。用引物对AD-SlMYB32-F/AD-SlMYB3

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