斑马鱼发育缺陷，神经元丢失和Synuclein聚集与LRRK2的破坏有关外文翻译资料

斑马鱼发育缺陷，神经元丢失和Synuclein聚集与LRRK2的破坏有关

原文作者：Shubhangi Prabhudesai,1 Fatima Zahra Bensabeur,1 Rashed Abdullah,1 Indranil Basak,1 Solange Baez,1 Guido Alves,2 Nathalia G. Holtzman,3 Jan Petter Larsen,2 and Simon Geir Moslash;ller1,2*

单位：1纽约皇后区圣约翰大学生物科学系

2挪威斯塔万格大学医院，挪威斯塔万格挪威运动障碍中心

3纽约皇后区纽约市立大学生物系，皇后学院和研究生中心

虽然富含亮氨酸激酶2（LRRK2）基因的突变是最常见的造成帕金森疾病的原因，LRRK2基因的功能在很大的程度上也是未知的。LRRK2本质上是多效性的，表现在参与神经变性和更周边的过程中，包括大鼠和小鼠的肾功能。最近的学术报告指出关于斑马鱼删除LRRK2 WD40域可能会也可能不会影响多巴胺能神经元或运动。研究表明50％LRRK2在斑马鱼中破坏不仅引起神经元损失，而且还引起发育诸如轴曲率缺陷之类的干扰，眼睛异常和眼睛，晶状体和耳部水肿囊泡。我们进一步研究LRRK2破坏后的结果，在神经元损失上表现更加明显，包括减少多巴精神神经元。免疫荧光显示内源性LRRK2在晶状体、脑、心脏、脊髓和肾脏（俯卧），这是镜像观察到LRRK2 morphant表型。在相应的上调结果中，b-突触核蛋白、PARK13和SOD1、并导致b-突触核蛋白在间脑、中脑，后脑和后视联合。 LRRK2 knock-down引起Na 1 / K 1 ATP酶前体在俯卧位导管中的错定位，表明水肿可能与肾功能不全和LRRK2有关，可能也与前肾小管上皮细胞有关。综合起来，我们的研究表明LRRK2在斑马鱼中具有多方面的作用，斑马鱼rep-resent a complementary模型可以进一步理解让我们对中心蛋白质的理解。

帕金森病（PD）是最常见的退行性运动障碍。PD的特点是多巴胺能神经元（DA）斯坦尼亚黑质致密部分和特征性DA水平的减少（Hirsch等，1988）。除了电动机症状以外，其他大脑区域的变化会产生非运动性症状（Braak等，2003; Poewe，2007）。更多的是，外周的自主神经系统也是会受到如此的影响，导致了心脏、胃肠道、肾脏，泌尿系统和皮肤异常（Djaldetti等，2009年; Hinkle等，2012）。

大多数PD病例是散发性的，但遗传性病变例如alpha;-突触核蛋白（SNCA; Polymeropoulos等，1997）、Parkin（Kitada等，1998）、PINK1（Valente等，2004）、DJ-1 / PARK7（Bonifati等，2003）和LRRK2（Pai-san-Ruiz等人）与PD有决定性的联系。LRRK2中的突变是造成家族性和散发性PD最常见的原因（Tan和Jankovic，2006），其中LRRK2 G2019S突变是最常见的突变与家族性PD分离（Deacute;chsel和Farrer，2010）。 LRRK2是一个大蛋白含有多种酶促和蛋白质 - 蛋白质相互作用域LRRK2催化枢纽包括ROC（复合蛋白Ras）GTP酶一个COR（ROC的C端）域，以及a丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，而蛋白质 - 蛋白质相互作用域包括 armadillo重复序列、锚蛋白重复序列、LRR（富含亮氨酸重复序列）和WD40域（Tan和Jankovic，2006; Mata等，2006;Cookson，2010; D echsel和Farrer，2010）。 LRRK2有已被证明与几种蛋白质相互作用，包括14-3-3蛋白（Nichols等，2010），HSP70相互作用蛋白质（Ko等人，2009）和Parkin（Smith等人，2005）。虽然LRRK2的酶学性质和一些相互作用能被了解但是LRRK2的功能不太明确。超活性LRRK2激酶活性导致细胞毒性和神经变性，而野生型（wt）LRRK2过表达则没有这样相同的效果（MacLeod等，2006）。虽然临床G2019S LRRK2突变导致增加激酶活性，对神经变性的影响尚不清楚（Gloeckner等，2006; Jaleel等，2007; Guo等，

2007）。 LRRK2敲除的小鼠具有完整的DA神经元但显示改变运动协调，肾衰竭并增加自噬活性（Hinkle等2012）。 LRRK2敲除小鼠和大鼠有几个肾脏异常（Tong等人，2012; Baptista等人，2013）。在斑马鱼中删除了LRRK2 WD40结构域导致帕金森症样表型和DA神经元的丧失（盛等人，2010），这是不同的小鼠功能丧失研究（Hinkle等，2012）。而且，一项单独的研究表明，删除LRRK2 WD40域不会导致DA神经元丢失或斑马鱼的运动缺陷（Ren等，2011）。尽管LRRK2基因敲除小鼠和大鼠的研究广泛关注肾脏异常（Tong等人2012; Baptista等，2013），到目前为止斑马鱼研究都有没有调查LRRK2击倒对肾的影响。在脊椎动物中，LRRK2及其旁系同源物LRRK1具有非常相似的域结构。即使这两者蛋白质在脑中表达，LRRK1和LRRK2在表达模式中显示差异，其中LRRK2在肾中显示高表达，而LRRK1在胃和肝中高度表达（Biskup等，2007）。迄今为止，没有报道过突变LRRK1与PD相关，尽管它出现了LRRK1和LRRK2起源于相同的祖先 - 他们的职能是非常不同的（泰勒等人，2007年）。虽然研究表明LRRK2有多重角色但是它在很大程度上还不清楚如何扰动LRRK2导致PD中的神经变性（Cookson，2010;Berwick和Harvey，2011; Schapira和Gegg，2011年）。它是合理的预期LRRK2具有多种角色并且在多向性中起作用方式。与以前的LRRK2斑马鱼研究相比，LRRK2的缺失在回应发育和神经退行性疾病的影响。我们展示斑马鱼LRRK2敲除导致神经变性并且还影响眼睛，身体轴线和肾脏脏。此外，LRRK2敲除影响中央PD相关基因的调控导致b-突触核蛋白聚集。我们的研究强调LRRK2和斑马鱼作为一个多效的LRRK2模型。

材料和方法（斑马鱼维护和注射）

斑马鱼（RRID：ZIRC_ZL1;斑马鱼国际资源中心，俄勒冈大学尤金，俄勒冈州）品种被设置在288℃的罐中，收集胚胎用于注射，轻微发作被假定为零后小时受精（hpf; Westerfield，2007）。LRRK2翻吗啉代（MO;50 -ACAACTCCTCTATTTCTGCCATGA T-3 0; LRRK2 ATG斜体），LRRK2五核苷酸（5-nt）错配控制MO（5 0 -ACAAGTGCTCTAATTCTCCCATCAT-3 0;不匹配斜体），标准MO控制（5 0 -CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3 0），P53MO（5 0 -GCGCCATTGCTTTGCAAGAATTG-3）和LRRK2剪接MO（5 0 -ATTACACTCCAACTT ACTTGTGTGC-3 0）在内含子3剪接供体接头E3I3处设计，引起外显子3缺失和早熟外显子4终止密码子，购自Gene Tools（Corvalis，OR）。所有MOs在室温（RT）下以1mM储存于无菌H 2 O中。MO储备溶液被稀释，含有0.16％红色苯酚中最终浓度为250mu;M（2ng / nl）。使用Femtojet显微注射器注入单细胞阶段的胚胎，LRRK2翻译MO和LRRK2剪接MO最初以2ng / ml的1-nl，2-nl和3-nl体积注射，nl浓度（每个胚胎2,4和6ng）剂量以确定以最小毒性挖掘最佳剂量。发现翻译和剪接MOs的剂量为4ng /为最佳。对于单次MO注射，翻译，拼接，匹配和标准阴性对照MOs各自注射在4纳克/胚胎。 2纳升体积的2ng / nl MO是注入以达到4ng /胚胎的最终浓度。该MOs的浓度不超过6ng /胚胎以预防任何脱靶效应。对于共注射实验，4ng p53MO与4ng翻译MO或4ng共注射拼接MO。四纳克的p53 MO过去常常被作为实验控制来使用。共注射中使用的p53 MO的浓度实验是按照既定的协议（Robu等人，2007）。两千九百三十二个胚胎注射LRRK2翻译MO，2,100个胚胎注射LRRK2 5-nt错配对照MO，510个胚胎注射一般对照MO，用LRRK2剪接MO，500注射1,260个胚胎，MO，500个胚胎与LRRK2 胚胎与LRRK2剪接MO / p53共注射MO / p53 MO和500个胚胎注射单独的p53 MO。HuC-GFP构建体，含有斑马鱼胚胎干细胞获得了驱动GFP的鱼神经元特异性HuC启动子来自Ajay Chitnis（美国国立卫生研究院）。对于一些共注射体验，2nl体积的含有HuC-GFP质粒的溶液DNA（80ng /mu;l）和LRRK2翻译MO（2ng /nl）或错配对照MO（2ng / nl）。细胞阶段胚胎。胚胎还注射2nl 80ng /mu;lHuC-GFP质粒DNA作为对照。本研究严格按照本研究进行由圣托马斯动物护理机构制定的规章制度约翰大学。协议1778.0和1779.0被用于这项研究并经圣约翰大学动物护理和使用委员会。圣约翰大学是AAALAC认可的。对于拯救实验，全长人类wt LRRK2cDNA从Addgene获得（质粒17609）。基因使用T7 Message Machine试剂盒（Life Tech-纽约格兰德岛）。确定最佳剂量为了拯救，将50,100,200或300pg人类wt RNA投入用4ng翻译MO注射，并确定200pg成为救援的最佳剂量。对照被注射仅4ng翻译MO。

逆转录酶-PCR

将剪接MO以4ng /胚胎注射到胚胎中。从野生型和剪接形态提取总RNA。胚胎3天后使用RNA纯化试剂盒（Thermo Fisher Scientific）。利用RevertAid合成DNA（cDNA）第一链cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific）使用斑马鱼LRRK2基因特异性反向引物（5 0 -ACTTCATGGCCTCCAGAATCG-3 0）。 然后是第一链cDNA用正向引物（5 0 -TGTCCATCA）进行PCRGACTGAAGAAGC-3 0）和反向引物（5 0 -ATTCCTCCTCATC CAGAACCTGC-3 0）导致扩增的423nt重DNA片段和另一个325nt接头morphant DNA片段。morphant DNA片段被克隆并通过DNA测序验证。

定量RT-PCR

来自WT的斑马鱼胚胎，72hpf，错配，和用剪接的morphants进行RNA纯化GeneJET RNA纯化试剂盒（Thermo Fischer Scientific），随后使用RevertAid First-Strand进行cDNA合成cDNA合成试剂盒（Thermo Fischer Scientific）。 cDNAs被用于定量RT-PCR伴随 PerfeCTa SYBRGreen Supermix用于（Quanta Biosciences，MD）和5 0 -ATATGGCAGAAATAGAGGAGTTGT CC-3 0作为前引物和5 0 -ATTAGTCCACCGGTCTGGCC 3 0作为反转录引物U6被用作内源性对照来标准化表达LRRK2。 所有的实验和测量都是一式三份地进行。

斑马鱼整体免疫荧光

展示神经元特异性GFP表达的胚胎在24 hpf通过使用尼康T2000S倒置荧光鉴定。 在48 hpf时，胚胎被脱髓鞘并用磷酸盐缓冲的4％多聚甲醛固定盐水（PBS）室温放置1小时。 胚胎被洗涤两次与PBST（PBS，0.1％[v / v]吐温20）一起在冰上透化，冷丙酮8分钟，并用PBST洗涤。胚胎在10％正常山羊血清中封闭1小时并且用纯化的兔单克隆抗LRRK2优先抗体（1:100; Abcam，Cambridge，MA）或纯化小鼠单克隆抗Na 1 / K 1 ATP酶抗体（1：200;Developmental Studies Hybridoma Bank）48℃过夜。将胚胎用PBST洗涤两次，与PBS一起温育适当的二抗（1：200 [Alexa fluor 594山羊抗兔]或1：200 [IgG Dylight 550山羊抗小鼠]在室温放置2小时，用PBST洗涤，在尼康T2000S荧光倒置显微镜上成像。

斑马鱼切片的免疫荧光

全身免疫荧光按照如上所述用兔多克隆抗-b-突触核蛋白抗体（1：200; Abcam）。胚胎用4％多聚甲醛于PBS中1小时，用PBST洗涤两次，储存以PBS / 30％（wt / vol）蔗糖在RT下包埋2小时最佳切割温度（OCT）化合物和cryosectioned（10 lm部分）。 用尼康拍摄部分图像T2000S荧光倒置显微镜。

整体免疫染色

通过显微镜进行了多巴胺能神经元整体免疫染色检查。在72hpf时，胚胎被立即脱髓鞘置于4％PFA中。 胚胎在4％PFA中固定过夜，8℃，然后在PBS中洗涤两次，然后在冰冷中透化丙酮并在20分钟内放置8分钟，然后洗涤三次在PBS中。 然后将胚胎在3％H 2 O 2中漂白10次分钟，然后用PBS洗涤三次。 用10％绵羊血清在PBSDtx中封闭（13PBS11％DMSO1.3％TritonX-100）2小时在NSS-PBSDTx中用抗TH抗体（1：100;加拿大安大略省渥太华Chem-icon; AB152）过夜，最后与山羊抗兔IgG（H 1 L）Alex-aFluor 488二抗（1：200; Thermo Fischer Scientific;A-11034）。

Western印迹

一个细胞阶段的斑马鱼胚胎注射4纳克。将胚胎裂解并重悬于1％Triton高盐中裂解

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