LRRK2 / PARK8的丢失诱导果蝇中多巴胺能神经元的退化外文翻译资料

LRRK2 / PARK8的丢失诱导果蝇中多巴胺能神经元的退化

原文作者 ：Sung Bae Lee, Wonho Kim, Sungkyu Lee, Jongkyeong Chung

国家创新研究计划中心细胞生长调节和生物科学系，韩国高等科学技术研究所，大韩民国大田区裕松区库松洞373-1 305-701。

韩国大韩高等科学技术大学文化技术研究生院大韩民国大田305-51，Y松区辜松洞373-1。

2007年4月19日收到
2007年5月4日在线提供

摘要

LRRK2 / PARK8突变与帕金森病的常染色体显性形式有关，但LRRK2相关帕金森病的致病机制尚未完全了解。此外，LRRK2的体内功能至今尚未解决。因此，我们为LRRK（一种人类LRRK2的唯一果蝇同源基因）产生并表征了转基因动物和失去功能的突变体。尽管致病突变体和野生型LRRK的转基因表达没有显示任何重要的缺陷，但LRRK功能丧失突变体显示出严重受损的机车活动。此外，LRRK突变体中的多巴胺能神经元显示酪氨酸羟化酶免疫染色和缩小形态的严重减少，暗示它们在突变体中变性。综上所述，我们的发现空前表明LRRK2对果蝇中多巴胺能神经元的完整性和完整的定位活性至关重要。

关键词：帕金森病;酪氨酸羟化酶

帕金森病（PD）是一种常见的神经退行性疾病，在北美有超过一百万人患病。 PD的主要症状是机车缺陷，包括僵硬，震颤，运动迟缓以及伴随多巴胺神经元（DA）神经元选择性变性的不良平衡[1]。迄今为止，七个基因，a-突触核蛋白（PARK1），parkin（PARK2），UCH-L1（PARK5），PINK1（PARK6），DJ-1（PARK7）以及最近鉴定的LRRK2（PARK8）和ATP13A2 PARK9）已经被家族基因连锁分析和定位克隆分离出来，负责PD [1,2]。在这些基因中，alpha;-突触核蛋白和LRRK2突变与自身皮肤显性帕金森综合征有关，而parkin，PINK1，DJ-1和ATP13A2突变与早发性自身隐性帕金森综合征（AR-JP）有关[1，2]

在LRRK2相关PD的研究中，在编码基因中发现了9个致病基因突变位点。特别是在某些人群中，PD中LRRK2突变的频率显着高达总PD病例的40％[3，4]。 然而，关于LRRK2的生物学功能和LRRK2相关PD的致病机制知之甚少。 因此，为了阐明LRRK2的体内功能，我们为LRRK（一种人类LRRK2的唯一果蝇邻位）产生了功能获得和功能丧失突变体。 使用这些LRRK突变体，我们证明LRRK2是正确维持果蝇中DA神经元所必需的。

材料和方法

飞股票。 G7459系列由Gen Exel（韩国）提供。 e03680（LRRK P1）系从Har-vard大学的Exelixis Collection获得。 PINK1 B9突变系已被描述[5]。 UAS-mito GFP系获自H.J. Bellen博士（贝勒医学院）[由Drs。 A. Pilling和W. Saxton（印第安纳大学）]。TH-GAL4系列产品是S. S. Birman博士（法国国家科学研究中心 - 法国Universite de la Mediterranee）的礼物。 mef-GAL4系列由E.N.博士亲切提供。 奥尔森（达拉斯德克萨斯大学西南医学中心）。 UAS-GFP，UAS-lac Z，elav-GAL4，gmr-GAL4和hs-GAL4系是从Bloomington Stock Center（Bloomington，IN）获得的。

产生LRRK转基因和丧失功能的荧光蛋白。 将LRRK的全部开放阅读框（ORF）（来源于果蝇成虫c DNAs）亚克隆到N末端FLAG标记的p UAST载体中。 生成的构建体进行DNA测序验证，然后显微注射到w1118胚胎中以产生转基因小球。 另外，通过不精确切除G7459的P元件产生LRRKex1等位基因。

免疫印迹分析。 免疫印迹分析如先前所述[2]进行，具有2天龄的小鼠。 使用小鼠抗FLAG抗体（1：500，Sigma）和抗b-微管蛋白（E7）抗体（1：1000，DSHB）。 为了诱导转基因表达，在37℃热激2小时，然后在25℃孵育3小时。

肌肉结构。 如前所述进行肌肉切片和组织染色[5]。

免疫染色和TUNEL分析。 将成年大脑和幼虫眼成像盘用4％多聚甲醛固定并用PBST（PBS 0.1％Triton X-100）中的3％BSA封闭。 用于本研究的一抗为抗TH兔抗体（1:10，Pel-Freez），抗FLAG小鼠抗体（1：100，Sigma）和抗b半乳糖苷酶（JIE-7）小鼠抗体（1 ：100，DSHB，爱荷华大学）。 对于成人大脑，通过LSM510共焦显微镜获得Z-系列图像。 TUNEL检测使用原位细胞死亡检测试剂盒（Roche）在10日龄小鼠的胸腔中进行。 使用Hoechst33258（Sigma）观察肌肉中的细胞核。

定量PCR（q PCR）。 对于实时PCR，通过Easy-Blue系统（Intron，韩国）提取总RNA，并使用寡核苷酸T逆转录试剂盒（Promega，WI）进行逆转录。 然后，在i Cycler i Q多色实时PCR检测系统（Bio-Rad）上使用SYBR Premix Ex Taq（Takara）进行PCR。 以下引物用于扩增LRRK转录物（5-GTGGCTGTCGGAACGCATAAC-3和5-GCCGCACCACAATTCATAG-3）。 测量rp49水平的内部对照。

生育力和繁殖力测定。 生育力测定按前述方法进行[5,7]。 为了生殖力测定，收集10只交配雌性（3日龄或10日龄）的卵24小时，并计数产下的卵的数量。

运动测定。 如前所述进行爬升速度测定[5]。

量化和统计分析。 使用Adobe Photoshop测量TH染色强度：通过比较从突变体获得的测量像素数与从对照获得的测量像素数的平均值来确定相对强度。 为了量化DA神经元，每个基因型的10个大脑以盲方式观察以消除偏差。

结果与讨论

鉴定人类LRRK2的果蝇直系同源物

果蝇LRRK基因（CG5483）编码2351个氨基酸的多肽，其包含高度保守的特征基序，富含亮氨酸的重复（LRR）结构域，复合蛋白Ras（ROC）结构域和丝氨酸/苏氨酸激酶结构域 图1A）。 这些图案分别与人类LRRK2的相似性分别为38％，46％和44％（图1A）。 首先，我们观察了LRRK的表达模式，并发现它在成人中的转录在头部特别高（图1B）。 这一结果暗示了LRRK2在大脑中的潜在作用，这与以前的报道一致，表明LRRK2在哺乳动物的神经元细胞中强烈表达[8-10]。

LRRK转基因表型的表征

为了解LRRK2相关PD的致病机制，我们针对LRRK2相关PD患者中致病性Arg1441Cys突变产生了野生型LRRK（LRRK WT）和含有Arg1069Cys突变的突变体（LRRK RC）的FLAG标签转基因等位基因 （图1A）[11]。 我们使用免疫印迹（图1C）和免疫组化（图1D）分析证实hs-（诱导全身表达）和gmr-（诱导眼特异性表达）GAL4驱动因子对转基因等位基因中的外源LRRK蛋白的强诱导， 分别。 由于LRRK2突变与人类PD的主要形式有关[11-13]，我们推测LRRK RC的异位表达诱导疾病表型，例如机车缺陷和DA神经元变性。然而，通过包括hs-，tub-（诱导全身表达），mef-（诱导肌肉特异性表达）和TH-（诱导DA神经元特异性表达）的各种GAL4驱动剂表达LRRK RC和LRRK WT， 司机没有诱发显着的行为缺陷（图1E和数据未显示）。 与这些结果一致，转基因小麦中DA神经元的细胞数目（图1F）和线粒体（图1G）似乎是正常的（图1G）。 此外，elav-GAL4驱动的泛神经元LRRK WT和LRRK RC的表达并不影响大脑的总体结构（补充图1A）。

由于我们观察到PINK1和parkin突变体中的肌肉退化和线粒体功能障碍[5]，我们检测了肌肉中LRRK WT和LRRK RC转基因表达的效果。 然而，LRRK肌肉特异性表达通过mef-GAL4驱动的WT和LRRK RC不会引起肌肉结构和线粒体缺陷（补充图1B）。 在转基因水稻的肌细胞中也没有观察到细胞凋亡（补充图1C）。 综上所述，果蝇中未检测到致病性LRRK2突变（LRRK2 RC）的显性效应。

产生LRRK功能丧失突变体

接下来，我们决定通过产生LRRK功能缺失突变体来研究LRRK的内源作用。我们发现了一个piggy Bac系（e03680），其中piggyBac元件被插入到LRRK的编码序列中，而另一个EP - 元件线（G7459），其中EP元件插入在LRRK的3UTR附近（图2A）。 我们使用定量RT-PCR检测其纯合体是否为LRRK的功能缺失突变体。 因此，我们发现LRRK转录本的表达在纯合e03680株系中显着降低，表明e03680株系是LRRK的功能丧失株系（图2B）。 因此，我们将这个等位基因重新命名为LRRK P1。 然而，LRRK表达在纯合G7459株系中未受影响（数据未显示），所以我们通过不精确地切除G7459株系中的EP元件产生了另一功能丧失等位基因LRRK ex1（图2A）。 在LRRK ex1中，删除了包括LRRK编码序列的终止密码子的464bp（图2A）

LRRK功能丧失突变体中DA神经元的退化

LRRK突变体的纯合子女性显示出生育力和繁殖力的显着降低，两者随着年龄的增长而变得更严重，而纯合子雄性则完全可育（图2C和D，数据未显示）。 有意思的是，我们还发现纯合的LRRK P1和LRRK ex1突变体显示出显着的机车活动受损，其通过LRRK WT的转基因表达恢复（图2E和F，数据未显示），表明它们的机车缺陷是由于 到LRRK的损失。

为了揭示突变体中机车缺陷的生理原因，我们首先检查了LRRK功能丧失突变体的肌肉结构。 然而，我们无法找到肌肉结构或线粒体中任何明显的缺陷（图2G）。 接下来，我们检查了突变体中DA神经元的缺陷。虽然突变体中DA神经元的数量与野生型对照中的DA神经元数量没有差异（图2H），但我们发现突变体在DA神经元中显着降低抗酪氨酸羟化酶（TH）染色强度，特别是在 DM和PM区域（图3A-C，补充图2A-C）。这种表现型以及机车缺陷（图2E和F）早在蛹退化后3天就检测到（补充图2），随着年龄的增长而变得更加严重（图3C，补充说明 图2C）。 此外，我们发现突变体的DM区域中的DA神经元显示出缩小的形态学（图3B，补充图2B），表明LRRK突变体中DA神经元的选择性变性与PINK1和parkin突变体中一样[5，14,15]。 总的来说，这些结果暗示LRRK2在果蝇中的DA神经元中起关键作用。

在目前的研究中，通过产生和表征LRRK转基因等位基因和功能丧失突变体，我们清楚地证明了LRRK2在预先放松DA神经元变性中的内源作用，而大多数关于LRRK2相关PD的前期研究 哺乳动物通过使用过表达系统集中于致病性LRRK2突变的主要毒性效应。 因此，我们相信这些发现为PD的研究提供了宝贵的见解，而且我们的系统将有助于未来研究LRRK2相关PD的致病机制。

致谢

我们真的很感谢Drs。 H.J.贝伦，A. Pilling，W. Sax-ton，E.N. Olson和S. Birman的支持。 我们要感谢Chung的实验室成员进行有益的讨论。我们还感谢发展杂交瘤库（爱荷华大学）提供JIE-7（抗b-半乳糖苷酶）和E7（抗b-微管蛋白）抗体。

附录A.补充数据

与本文相关的补充数据可以在网上找到，网址为：10.1016 / j.bbrc。2007.04.156。

图1. LRRK转基因表型的表征。 （A）人和果蝇之间LRRK2的保守结构域结构。 LRRK RC突变位点标有星号。 （B）通过q PCR分析头部，胸部和腹部中LRRK的转录水平。使用核糖体蛋白49（rp49）作为内部对照。 （C，D）通过免疫印迹（C）和免疫组织化学（D）分析来检测hs-（C）和gmr-（D）GAL4驱动因子对LRRK转基因的诱导作用。将微管蛋白免疫印迹用于上样对照（C）。 gmr-GAL4在三龄幼虫的眼睛成虫盘的后部区域诱导强烈的转基因表达（红色）（D）。 （五）比较30天的爬升率。条表示平均值plusmn;SD。 （F）用抗beta;-半乳糖苷酶抗体成人脑免疫染色以标记DA神经元（绿色，左图）。 DM，背内侧; DL，背外侧; PM，后内聚群。显示30天时每个簇中DA神经元数量的图（右图）。每条代表来自10个不同大脑的平均值plusmn;SD。 （G）检查表示基因型的3日龄成年大脑DA神经元（红色）中的线粒体（绿色）。 （关于本图例中对颜色参考的解释，读者可参考本文的网页版。）

图2. LRRK功能丧失突变体的产生及其机车缺陷的表征。 （A）LRRK（CG5483）的基因组结构。 外部用箱子表示。 表示e03680（LRRK P1）和G7459的P元件插入位点。 还显示了LRRK ex1的删除区域。 （B）通过qPCR分析所表示的基因型成人中LRRK的转录水平。 rp49被用作内部对照。 （C）比较肥力。 （D）繁殖力的比较。 （E，F）攀登率的比较。 在（F）中，检查3天龄男性的爬升率。 条表示平均值plusmn;SD。 （G）30日龄男性胸部的纵切面。 （H）显示30天时每个簇中DA神经元数目的图。 每条代表来自10个不同大脑的平均值plusmn;SD。

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