斑马鱼中LRRK2的WD40结构域的缺失导致帕金森病 ——神经元丢失和运动的缺陷外文翻译资料

斑马鱼中LRRK2的WD40结构域的缺失导致帕金森病

——神经元丢失和运动的缺陷

作者：Donglai Sheng1, Dianbo Qu1, Ken Hon Hung Kwok1, Seok ShinNg1, Adrian Yin Ming Lim2, Sharon SiqiAw1, Charlie Wah Heng Lee3, Wing Kin Sung3, Eng King Tan4, Thomas Lufkin2, Suresh Jesuthasan5,6,Mathavan Sinnakaruppan2, Jianjun Liu1

1新加坡基因组研究所人类遗传学系，A * STAR，新加坡，新加坡，2新加坡基因组研究所干细胞与发育生物学系，A * STAR，新加坡，新加坡，3新加坡基因组研究所计算与数学生物学系，新加坡基因组研究所A * STAR，4新加坡国立神经科学研究所和新加坡杜克国立大学研究生医学院，5神经科学合作研究，A * STAR，新加坡，新加坡6新加坡国立大学生理学系，新加坡，新加坡、

专业名称：生物技术 学生姓名:王越洋 指导老师姓名：盛东来

摘要：LRRK2在帕金森病（PD）中发挥重要作用，但其生物学功能在很大程度上是未知的。在这里，我们克隆人类LRRK2的同系物，表征其表达，并调查其在斑马鱼中的生物学功能。该斑马鱼LRRK2（z LRRK2）蛋白被吗啉代阻断导致胚胎致死和严重的发育缺陷，如生长迟缓和神经元丢失。相反，通过靶向剪接的吗啉代敲除z LRRK2的WD40结构域不会诱导严重的胚胎发育缺陷;而是引起帕金森病样表型，包括间脑中多巴胺能神经元的丢失和运动缺陷。这些神经变性和运动缺陷可以通过过量表达z LRRK2或h LRRK2 m RNA来拯救。左旋多巴的给药也可以挽救运动缺陷，而不是神经变性。总之，我们的结果证明z LRRK2是h LRRK2的直系同源物，并且z LRRK2的WD40结构域的缺失为PD提供疾病模型。

关键词：帕金森病（PD），LRRK2, WD40结构域

引言：帕金森病（PD）是一种常见的神经退行性疾病，其特征是黑质致密部（SNpc）的多巴胺能神经元的选择性丢失和运动症状，包括静止性震颤，僵硬和姿势不稳定性。 绝大多数PD患者是特发性的，但少数患者表现出家族遗传，其中alpha;-突触核蛋白，Parkin，DJ-1，遍在蛋白-C-水解酶-L1（UCHL1）或富含亮氨酸重复激酶2（ LRRK2）起着重要的作用。

在已鉴定的PD疾病基因中，LRRK2突变在家族性和散发性PD患者中最为普遍，并且在人群分布和功能影响方面表现出令人感兴趣的多样性。例如，发现激酶结构域内的G2019S变体是高穿透功能获得性功能突变（与增强的激酶活性相关）;它似乎是除了亚洲人之外的大多数研究人群中最常见的突变。相反，WD40结构域中的G2385R变体导致功能丧失突变（与激酶活性降低相关），是亚洲人群中常见的易感性等位基因，但在高加索人中不存在。 LRRK2蛋白多个结构域内多种致病性突变（见下文）以及这些突变影响PD发育的复杂机制表明LRRK2可能是疾病发展的主要调节因子。因此，LRRK2不仅在临床上将PD的家族性和散发性形式联系起来很重要，而且对于理解疾病的病因学也具有生物学意义。

然而，LRRK2的生物功能在很大程度上是未知的。人类LRRK2（h LRRK2）编码由多个功能结构域组成的非常大的蛋白质，包括犰狳重复序列，锚蛋白重复序列，两种酶促S / T激酶和Roc GTPase结构域，COR和WD40结构域（作为二聚化基序），表明LRRK2是一种复杂的多功能蛋白。 LRRK2的功能研究主要是通过在体外和体内模型系统中过表达MAPKKK的野生型或突变等位基因和h LRRK2的ROC结构域来进行的。这些转基因研究表明LRRK2的高活性激酶活性可能具有细胞毒性并引起神经变性。然而，野生型人类LRRK2蛋白的过量表达并不总能达到相同的突变效应，如在大鼠研究中所证实的，提出了一个问题，即从突变等位基因的这种“功能获得”分析可推断多少了解LRRK2的正常功能。当使用moesin作为底物测量LRRK2突变的激酶活性时，最常见的突变G2019S是唯一显示刺激的突变激酶活性。因此，LRRK2突变诱导PD的机制比以前想象的更复杂，并且不仅是由于LRRK2激酶活性的增加。果蝇功能丧失突变分析（d LRRK2）揭示了相互矛盾的发现;目前还不清楚是否对LRRK的干扰功能在这个模型系统中引起帕金森综合征样神经变性和动力学缺陷。到目前为止，还没有关于WD40或其他结构域在脊椎动物模型（例如小鼠或大鼠）中的功能的报道，并且针对LRRK2的减少的激酶模型非常有限。

在这项研究中，我们首次在斑马鱼中进行了LRRK2的体内功能缺失研究。 我们克隆了人类LRRK2的斑马鱼同系物，并进行了一系列分子和遗传分析，以表征其表达和生物学功能，特别是WD40结构域在胚胎和神经元发育中的作用。

结果: h LRRK2的斑马鱼直向同源物的分子克隆

通过对h LRRK2蛋白质序列对斑马鱼c DNA序列的TBLASTN分析和随后的对鉴定的斑马鱼c DNA序列对人c DNA序列的TBLASTX分析，我们将XM_682700鉴定为h LRRK2的斑马鱼同系物。为了克隆z LRRK2的全长转录物，我们使用从成年鱼的脑中分离的m RNA进行了进一步的RACE分析，并鉴定了携带起始密码子和终止密码子的9168bp转录物。该转录本的大小与通过Northern分析检测到的zlrrk2 m RNA相匹配。该9168bp转录物由51个外显子组成，跨越118kb基因组序列（chr25：37299901-37361611，UCSC Genome Browser，2008年12月）并编码2533个氨基酸残基的蛋白质。这实验克隆全长转录本不同于由59个外显子组成并且编码2470个氨基酸残基的蛋白质的7410bp的ensembl预测的c DNA。 z LRRK2蛋白含有h LRRK2蛋白的所有功能结构域。 z LRRK2和h LRRK2蛋白之间的氨基酸序列具有高度保守性，在激酶结构域内保守性最高（71％）。系统发育分析表明，z LRRK2蛋白与h LRRK2蛋白以及其他动物物种的LRRK2蛋白聚在一起.

z LRRK2在斑马鱼中的表达谱分析

通过定量RT-PCR（q RT-PCR）进行的时间表达分析表明，在前MBT（中期囊胚转变：从一个细胞到球体）阶段可以检测到zlrrk2的母本m RNA，然后在开始时降解的原肠阶段。 Zlrrk2的合子表达在尾芽阶段（原肠胚形成的最后阶段）首次检测到，在分化和咽部阶段逐渐增加，在受精后24小时（hpf）达到峰值。经过短时间的还原后， zlrrk2的表达增加再次通过孵化和幼虫阶段，至少在受精后10天（dpf）。在24hpf和6dpf时，通过整体原位杂交（WISH）分析可以在脑中检测到zlrrk2的强表达，并且zlrrk2在大脑中的表达无处不在。在成年鱼（超过三个月）中，通过Northern印迹和q RT-PCR分析在大脑，肌肉，卵巢和肠中检测到zlrrk2mRNA，但是通过Western印迹在脑中主要检测到全长zRRRK2蛋白。

通过吗啉代击倒z LRRK2蛋白质表达引起严重的胚胎缺陷并丧失间脑酪氨酸羟化酶阳性（TH ）神经元

通过Western印迹分析确定，将ATG起始位点靶向的吗啉代显微注射到胚胎中有效地消除了z LRRK2蛋白的表达。敲低z LRRK2表达导致严重的胚胎致死率（在64d胚胎中检测到90％）在3dpf内。幸存的morphants显示发展迟缓，如生长缓慢，脑部大小减少，心脏水肿相比野生型鱼。 WISH分析显示存活的morphant的间脑中的TH 神经元丢失，这与通过蛋白质印迹分析检测到的酪氨酸羟化酶水平降低一致。心脏水肿和TH 神经元丢失表型是吗啉代浓度依赖性的并且可以是部分的通过人LRRK2的过量表达拯救（z LRRK2未用于拯救，因为它的表达将被ATG吗啉代阻断）。然而，由于发育迟缓，目前还不清楚间脑中TH 神经元的损失是否表明z LRRK2的特定作用。 z LRRK2敲除的严重胚胎缺陷也阻碍了我们研究其对机车运动的影响。

WD40结构域缺失导致神经变性，包括多巴胺能（DA）神经元的损失和脑中的轴突排列紊乱

已经显示WD40结构域内的G2385R变体与PD发育的非常中等的风险相关联。因此，我们推测WD40结构域的缺失可能导致比z LRRK2表达的翻译区块更弱的表型，使我们能够研究z LRRK2在神经发育和机车运动中的特定作用。为了删除WD40结构域，我们设计了特异性中断zlrrk2的第45个外显子的剪接的morpho-linos，并因此在WD40结构域的上游引入了预成熟终止密码子。通过RT-PCR和测序分析证实，将剪接阻断的吗啉代递送到胚胎中导致产生不含WD40结构域（z LRRK2-DWD40）的截短的zlrrk2mRNA。据推测，z LRRK2-DWD40 morphants显示出大致正常的胚胎发育，至少高达7 dpf，没有任何明显的形态学缺陷，除了游泳 - 膀胱和yolksac之间的轻度血液积聚。 Western印迹分析整个z LRRK2-DWD40 morphants（3 dpf）的鱼裂解物显示出全长（280KD）z LRRK2蛋白和TH蛋白表达的显着损失。通过qRT-PCR分析也证实TH表达的降低。一致的是，WISH分析（3 dpf）显示z LRRK2-DWD40 morphants的间脑中的TH / DAT DA神经元的损失。如预期的那样，z LRRK2-DWD40 morphant的表型是吗啉浓度依赖性的。

为了进一步研究z LRRK2-DWD40对神经发育的影响，我们将z LRRK2-DWD40 morpholinos显微注射入Tg（Delta D：GAL4 / UAS：-Kaede）系的胚胎中，其中神经元由Kaede表达标记（由德拉D启动子）。在胚胎发育的18个体节阶段，在DWD40 morphants中没有观察到明显的神经元细胞损失（与野生型鱼相比）。在6 dpf，morphant的前脑和后脑似乎是正常的并且与对照无法区分但是中脑，尤其是视神经的视顶盖比对照兄弟姐妹的神经元少得多。使用TUNEL测定法，我们在整个z LRRK2-DWD40 morphants中发现增强的细胞凋亡。我们还使用乙酰化微管蛋白抗体对轴突微管进行了染色，发现轴突束的减少和解体，最突出的是z LRRK2-DWD40 morphant的视顶盖。这些结果表明WD40结构域的缺失导致神经元的损失以及脑中轴突束的减少和解体，包括在morphants的间脑中的DA损失。野生型z LRRK2或h的过表达LRRK2可以拯救z LRRK2-DWD40 morphants的DA神经元损失和轴突道解体，证实神经元 - z LRRK2-DWD40形态的有效表型是由于剪接阻断吗啉代导致的WD40结构域缺失的特异性作用，而不是脱氧核糖核酸的脱靶效应或非特异性毒性。此外，成功的救援野生型h LRRK2的神经退行性表型证实z LRRK2是h LRRK2的功能性直向同源物。

z LRRK2的WD40结构域缺失导致a运动缺陷

为了研究z LRRK2-DWD40 morphants的运动行为，我们在30秒的时间窗内测量了幼鱼的游泳距离。 z LRRK2-DWD40 morphants比野生型鱼移动了更小的距离。 如同神经变性缺陷一样，这种减少的游泳活动可通过过度表达LRRK2或LRRK2来拯救。有趣的是，这种LRRK2-DWD40 morphants的游泳活性降低也可以通过给予左旋多巴（左旋多巴 ），一种广泛用于治疗PD的化合物。 然而，如通过TH标记所证明的，左旋多巴的施用不拯救神经变性的神经退行性表型。

人类LRRK2 G2019S和G2385R突变等位基因在斑马鱼中的过表达

除了研究WD40缺失之外，我们还研究了人类LRRK2 G2019S和G2385R突变体等位基因在斑马鱼中过表达的影响。 两个突变等位基因的过度表达可以诱导相似的血液作为z LRRK2-DWD40缺失的swim囊和卵黄囊之间的积累以及与野生型相比TH 细胞的轻度损失。 此外，与野生型z LRRK2和h LRRK2不同，h G2019S和h G2385R等位基因都只能部分挽救z LRRK2-DWD40 morphants中TH 神经元的损失。

论述:在这项研究中，我们提供了强有力的证据是Z LRRK2是h LRRK2的同源物。 z LRRK2和h LRRK2的蛋白质显示出氨基酸序列的保守性并且具有相同的结构域。 系统发育上，z LRRK2与h LRRK2，而不是h LRRK1以及其他动物物种的LRRK2蛋白聚在一起。 最后，通过过表达LRRK2mRNA成功拯救z LRRK2 基因的缺陷，在神经退化和游泳异常方面，为斑马鱼和人之间的LRRK2的功能保守性提供了最有说服力的证据。

z LRRK2在斑马鱼中表现出动态表达谱。在胚胎发育过程中，z LRRK2转录本主要限于脑，但在小鼠，大鼠和人脑中表现出在脑内普遍存在的表达。在成年鱼中，表达zlrrk2 m RNA 在多个组织或器官

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