基于CRISPR / Cas9介导的斑马鱼定向诱变的高通量功能基因组学工作流程外文翻译资料

基于CRISPR / Cas9介导的斑马鱼定向诱变的高通量功能基因组学工作流程

Gaurav K Varshney，Blake Carrington，Wuhong Pei，Kevin Bishop，Zelin Chen，Chunxin Fan，Lisha Xu，Marypat Jones C LaFave，Johan Ledin，拉曼苏德和Shawn M Burgess

美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家人类基因组研究所翻译和功能基因组分部发育基因组部门。 功能和化学基因组学计划，俄克拉荷马州医学研究基金会，俄克拉荷马城，俄克拉荷马州，美国。 斑马鱼核心，翻译和功能基因组分支，国立人类基因组研究所，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院。 上海海洋大学水产种质资源开发利用教育部重点实验室，中国上海。 癌症遗传学和比较基因组学分会，国家人类基因组研究所，美国马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院。 瑞典乌普萨拉乌普萨拉大学生命科学实验室有机生物学系。 现住址：美国圣地亚哥Synthetic Genomics。 这些作者同样对这项工作作出了贡献。 信函应寄给SMB（burgess@mail.nih.gov）。

2016年10月27日在线发布;DOI：10.1038 / nprot.2016.141

斑马鱼是用于研究发育和疾病的流行模型生物，并且基因修饰的斑马鱼为功能基因组研究提供了必要的工具。 许多出版物已经证明使用crIspr / cas9在斑马鱼中进行基因靶向的功效，并且它们包括用于指导rna合成和突变鉴定的各种工具和方法的描述。 但是，大多数已发布的技术不容易扩展以增加吞吐量。 我们最近描述了基于crIspr / cas9的高通量诱变和斑马鱼表型分型。 在这里，我们提供了一个完整的工作流程，包括目标选择; 无克隆单引导rna（sgrna）合成; 显微注射; 验证sgrnas的目标特定活动; 创始人筛选通过荧光pcr鉴定种系转导突变; 通过sanger或下一代测序确定确切病变（包括分析软件）; 和F或后代中的基因分型。 使用这些方法，可以在3天内评估sgrnas，斑马鱼可以在3个月内鉴定出种系发生突变，并且可以在6个月内建立稳定系。 实际上，两名研究人员可以将目标定为数十人

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每年使用该协议的数百个基因。

介绍

测序技术的进步使得通过全基因组分析研究能够快速鉴定候选人类疾病基因1 或全外显子组测序技术2。 然而，在鉴定这些候选疾病基因和它们的功能验证之间存在很大差距。 由于它有许多独特的特征，如快速发育，透明胚胎，高繁殖力和充分注释的基因组3- 斑马鱼已成为疾病基因功能验证的流行脊椎动物模型生物。 70％的人类基因在斑马鱼中至少有一个保守的ortholog，并且这些基因中的大多数在鱼类中执行类似的功能3。 直到最近，斑马鱼的功能基因组学主要依靠使用随机诱变方法产生的突变体4–7。 然而，针对性的基因组编辑工具，如锌指核酸酶（ZFN）8,9，转录激活剂样效应物核酸酶（TALEN）10,11 和CRISPR / Cas9核酸酶12–17，已被证明在斑马鱼中非常有效。 尽管ZFNs和TALENs明显有效，但低通量和费力的装配限制了它们在斑马鱼中的应用。 相比之下，RNA引导的CRISPR / Cas9系统在技术上更简单 - 指导RNA易于设计用于单个或多个目标基因座12,16并使得斑马鱼中的高通量，有针对性的诱变成为可能。

所有这些靶向诱变方法在靶位点产生双链断裂，其可以通过容易出错的非同源末端连接（NHEJ）来修复，或者如果供体DNA被提供，则是同源性定向修复。 虽然同源性定向修复往往是准确的，并且通常用于产生敲入等位基因，但易出错的NHEJ修复

方法经常在修复时留下插入或删除

被利用来产生基因敲除。

协议的开发

很多研究人员已经在斑马鱼中证明了CRISPR / Cas9在基因组编辑中的应用18。 我们产生了一种基因定义的斑马鱼品系以简化目标选择1919，用于测定sgRNA的体细胞活性的快速测定（CRISPR-体细胞组织活性测试（STAT））20以及用于策划已发布的sgRNA目标和活动的公共数据库21，相信转移sgRNA信息比转移实际突变斑马鱼更快更便宜。 我们已经使用我们的高通量诱变管道来产生最大的公布的斑马鱼生殖系传播数据集17。 在这里，我们提供了一个使用CRISPR / Cas9产生基因敲除斑马鱼细胞系的详细方案，该方案很容易从几个到几百个突变体进行扩增。

CRISPR / Cas9系统使用含有18到20nt目标序列的sgRNA，并将Cas9引导至目标位点。 可以使用任何可用的CRISPR / Cas9目标设计网络工具来选择目标站点。 为了促进我们实验室的定位，我们生成了UCSC基因组浏览器轨道，其中显示了整个斑马鱼基因组中所有可能的化脓链球菌Cas9（SpCas9）目标位点，包括每个指南预测的脱靶位点数17。 这些曲目可作为一个名为“斑马鱼基因组学”的公共数据中心提供http://genome.ucsc.edu/ 的cgi-bin / hgHubConnect.

影响靶向效率的另一个问题是近交系斑马鱼一般是不健康的，因此大多数斑马鱼都是不健康的

研究人员使用的“标准”毒株在每100个碱基中具有〜1的多态性率22。 这些变化可能会影响目标结合特异性，因为即使目标位点单个错配也会对sgRNA活性产生负面影响23。 为了提高我们的目标效率，使用所有变化已知的应变将是有利的。 因此，我们创建了NHGRI-1，这是一种非常有益的菌株，几乎所有父母的变异都通过高通量测序记录下来。 我们现在使用变异数据（和鱼本身）来选择避免多态性的目标网站，有助于确保首次尝试成功19。 变化数据是

F0

设计至少两个目标和荧光PCR引物（步骤1-9）1小时 - 1天

Oligo装配，sgRNA和cas9 mRNA合成（步骤10-27）1 d

用sgRNA和cas9 mRNA注射胚胎（步骤28-33）2小时

使用CRISPR-STAT方法进行体细胞突变分析（步骤34-48）1 - 2 d

如果检测到活动

如果没有检测到活动

剩余的注射胚胎成长至成年 x

WT鱼

也包括在UCSC基因组浏览器公共枢纽中

F1

与预测的CRISPR / Cas9目标位点轨道一致，允许

通过荧光PCR鉴定种系传递的创始人（步骤49-56）3 - 4 d

数据整合。

我们不需要改变在斑马鱼胚胎中注射mRNA的已有技术，但是我们确实开发了基于Microsoft Excel的计算器CRISPR-CALC（HTTP：//研究。 nhgri.nih.gov/CRISPRz/downloads/CRISPR_CALC.xlsx），以简化要注射的sgRNA和Cas9 mRNA量的计算20.

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由于目标诱变效率可能差异很大，因此我们需要开发评估sgRNA靶向效率的快速方法。 有几种评估sgRNA活性的方法，最常见的是PCR扩增靶位点，然后进行亚克隆和测序。 我们开发了一种可扩展，高通量和高分辨率的CRISPR-STAT，用于使用荧光PCR来评估注射胚胎中的目标活性20。 我们在注射后24-48小时收集八个未注射的和八个注射的胚胎，并使用基因特异性引物对和荧光标记的引物进行“三引物”荧光PCR。 然后使用毛细管电泳在遗传分析仪3130xl或3730xl上分离所得的荧光标记的扩增子。 然后，我们比较注射和未注射胚胎的片段大小峰，以检测野生型（WT）等位基因的折叠减少。 我们发现，评估注射目标的体细胞活性最大化获得基因突变体的可能性。 检测到体细胞活性的所有目标通过种系传递突变。

一旦确定了sgRNA效率，我们需要开发的最后一步是对F后代进行快速和简单的基因分型。 我们开发了基于PCR的协议，使用相同的技术 -

如同CRISPR-STAT的那些一样，强烈且快速地鉴定出移码突变，并且可以平行地使用索引样品和“下一代”测序进行测序17.

程序概述

实验工作流程总结在图1 并由斑马鱼靶标设计和sgRNA合成组成; 显微注射sgRNA / Cas9; 目标体细胞活性验证; 并筛选种系中的突变体。

目标选择和sgRNA合成。 我们建议至少选择两个目标站点; 我们的数据显示〜85％的目标具有足够的活性以产生种系突变17，因此使用两个目标确保几乎在所有情况下都能成功。 我们也倾向于尽可能定位蛋白质的已知功能域，或者是所有已知剪接变体共有的早期外显子。 为了选择sgRNA序列，我们使用UCSC基因组浏览器和我们预测的sgRNA靶标与T7或SP6合成

杂合子成员的鉴定和测序确认（步骤57-74）2 - 4 d

F2

表型分析

图1 | CRISPR / Cas9诱变管道概述。

RNA聚合酶选择避免多态性并且具有尽可能少的预测脱靶（lt;500首选）的指导。

对于sgRNA合成，我们使用无克隆寡核苷酸方法（图2a）。 这需要靶向特异性DNA寡核苷酸（顶链寡核苷酸，55-57nt）和导向RNA（底链Ultramer，80-nt）的“通用”DNA寡核苷酸。 靶特异性寡核苷酸含有17nt长的T7或SP6启动子，18-20nt靶序列和最终与指导RNA互补的20nt序列。 将两种寡核苷酸退火并用DNA聚合酶延伸，所得产物作为体外转录的模板。 该方法可用于在3-4小时内合成96个sgRNA。

显微注射。 将sgRNA和Cas9 mRNA（或蛋白质）共注射入单细胞阶段的胚胎中。 我们经常共同注射每个靶点25-50pg sgRNA和150-300pg Cas9 mRNA。 注射50mu;gsgRNA /150mu;gCas9或25mu;gsgRNA /300mu;gCas9导致类似的种系传递效率。 或者，也可以使用市售的Cas9蛋白质。我们使用Cas9蛋白质或将Cas9 mRNA注入细胞质中发现了相当的体细胞诱变效率。 为了使这种管道高通量，我们将sgRNA / Cas9 mRNA注入蛋黄中。 然而，如果目的是观察注射的胚胎中的表型，我们建议直接注入细胞; 这通常导致致突变效率的增加和两个等位基因同时突变的机会增加。 然而，如果目标是种系传播，则不建议进行细胞注射，因为以高诱变效率为靶标的基因基因可能会导致创始鱼存活不佳。

筛选和验证种系突变。 在评估体细胞组织中的sgRNA活性后，剩余的注射的胚胎升至成年。 我们通常使用我们的三引物荧光PCR方法筛选6-8个创始人鱼的种系突变（图2b 剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

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