二乙酰基二脱氧糖脱乙酰酶和外切-β-D-氨基葡萄糖苷酶在嗜热古细菌Thermococcus kodakaraensis KOD1新的几丁质合成途径中的协同作用外文翻译资料

二乙酰基二脱氧糖脱乙酰酶和外切-beta;-D-氨基葡萄糖苷酶在嗜热古细菌Thermococcus kodakaraensis KOD1新的几丁质合成途径中的协同作用

原文作者：Takeshi Tanaka，Toshiaki Fukui，Shinsuke Fujiwara，Haruyuki Atomi， and Tadayuki Imanaka

单位：Department of Synthetic Chemistry and Biological Chemistry，Graduate School of Engineering，Kyoto University，Katsura，Nishikyo-ku，Kyoto 615-8510 and Department of Life Science，School of Science and Technology，Kwansei Gakuin University，2-1 Gakuen，Sanda 669-1337，Japan.

摘要

超嗜热古细菌Thermococcus kodakaraensis KOD1内有降解壳多糖的几丁质酶（Tk-ChiA）和外-beta;-D-氨基葡萄糖苷酶（Tk-GlmA），后者将壳二糖（GlcN₂）水解成葡糖胺（GlcN）。为了鉴定生理学上连接这两种活性的酶，我们在此着重于来自GlcNAc₂的Tk-GlmA底物的脱乙酰酶。脱乙酰酶可在T.kodakaraensis细胞中检测到然后实现部分纯化，且相应的基因（Tk-dac）可以在基因组上鉴定出。将被诱导的氨基酸序列分为Lace蛋白家族，包括乙酰葡糖胺基 - 磷脂酰肌醇脱-N-乙酰化酶和1-D-myo-inosityl-2-乙酰氨基-2-脱氧-alpha;-D-吡喃葡糖苷脱乙酰酶。重组Tk-Dac显示了脱乙酰酶对N-乙酰半胱氨酸寡糖（GlcNAc_2-5）的活性，且脱乙酰化位点在非还原性GlcNAc残基上是特异性的。酶也将乙酰化GlcNAc单体。在T.kodakaraensis细胞中，GlcNAc₂诱导Tk-dac，Tk-glmA，Tk-chiA和簇聚基因的转录，表明该基因簇在体内分解代谢的功能。这些结果揭示了T.kodakaraensis中独特的几丁质分解代谢途径，其中由几丁质产生的GlcNAc₂通过Tk-Dac和Tk-GlmA的协同作用而降解。也就是说，GlcNAc₂通过Tk-Dac被位点特异性地去乙酰化成GlcN-GlcNAc，然后通过Tk-GlmA水解成GlcN和GlcNAc，然后通过Tk-Dac对剩余的GlcNAc进行第二次脱乙酰化步骤以形成GlcN。这是古细菌甲壳素分解代谢途径的首次阐述，并且还定义了一种使用脱乙酰化和切割组合的二聚体处理的新机制，与任何以前已知的途径不同。

介绍

几丁质是beta;-1,4-连接的N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）的线性均聚物，其生物产量是纤维素后最丰富的。真菌和细菌中几丁质的降解已经很好地被研究了，并且这些研究中揭示的几丁质分解代谢途径总结在图1A中（细箭头）。甲壳素通过内切和外切型几丁质酶（反应1和2）的组合降解内二去乙酰壳二糖（GlcNAc₂），接着用beta;-N-乙酰氨基葡糖苷酶（GlcNAcase;反应3），GlcNAc₂磷酸化酶（反应4）进行二聚体加工， GlcNAc₂磷酸转移酶系统（反应5）和6-磷酸-beta;-氨基葡萄糖苷酶（反应6）（1-4）。在这些途径中，去除起始甲壳素衍生的N-乙酰基基团发生在降解的非离子型表面活性剂之后。该步骤由GlcNAc-6-磷酸（GlcNAc6P）脱乙酰酶催化，其将GlcNAc6beta;-GlcNAc裂解产生的GlcNAc6P乙酰化（反应6）或通过磷酸化GlcNAc。甲壳素降解的另一种途径被认为是由几丁质脱乙酰酶脱乙酰化引发的（反应7）。然后与外切-beta;-D-氨基葡萄糖苷酶（GlcNase;反应9）（1）合作，由壳聚糖酶（内切酶;反应8）将得到的脱乙酰几丁质壳聚糖降解为葡糖胺（GlcN）。

与真核生物和细菌相反，关于古细菌中的胆碱分解的信息很少。我们以前报道过超嗜热古细菌Thermococcus kodakaraensis KOD1（5,6）的热稳定几丁质酶的第一个特征。该壳聚糖酶（Tk-ChiA）具有由双重催化结构域和三重几丁质结合结构域组成的独特结构域结构。双催化结构域可以单独切割具有不同概况的几丁质链，即N-和C-末端催化结构域分别显示exoandendo型切割特异性。其他来自嗜热菌Thermococcus chitonophagus（7）和激烈热球菌（8）的古细菌几丁质酶也有报道。来自超嗜热古细菌的这些几丁质酶，包括Tk-ChiA，产生作为几丁质终产物的GlcNAc₂。最近，我们在寻找参与GlcNAc₂分解代谢的酶的过程中发现了来自T.kodakaraensis的另一种几丁质酶酶GlcNase（9）。GlcNase（Tk-GlmA）将壳二糖（GlcN₂）水解成GlcN，并且由Tk-ChiA从几丁质的最终产物GlcNAc₂诱导。这些事实已经推断在T.kodakaraensis中存在GlcNAc₂特异性脱乙酰酶活性，以便从GlcNAc₂提供Tk-GlmA的底物（图1A，粗箭头）。

在这项研究中，我们从T.kodakaraensis进行了GlcNAc₂脱乙酰酶（Tk-Dac）的纯化和表征，并且澄清了一种以前未知功能的基因编码这种蛋白质。 Tk-Dac将乙酰甲基低聚半乳糖的非还原末端单元以及GlcNAc单体脱乙酰化，与Tk-ChiA和Tk-GlmA一起在该生物体中构成一种新型的古菌几丁质分解代谢途径（图1B）。

实验步骤

细菌菌株，质粒和培养基。 T. kodakaraensis KOD1在85℃下在800升MA培养基（分别为4.8g和26.4g Marine Art SF试剂A和B [分别为Senju Seiyaku，Osaka， 日本]，5g酵母提取物和5g胰蛋白胨在1升去离子水中的溶液）中加入丙酮酸钠盐（5g /升）和几丁质（1g /升）。 使用大肠杆菌TG-1和BL21-CodonPlus（DE3）-RIL作为源自pET-15b（Novagen，Madison，WI）的表达质粒的宿主，并在37℃下在LB培养基中培养。

来自T. kodakaraensis KOD1的GlcNAc₂脱乙酰酶的部分纯化。含有几丁质的T.kodakaraensis的培养液（11.2升）通过Toyo滤纸过滤。 101（Toyo Roshi，Tokyo，Japan）获得几丁质相关细胞。将几丁质颗粒上的细胞悬浮于缓冲液A（50mM Tris-HCl [pH9.0]，1mM EDTA）中，并通过超声破碎。通过离心（6,000xg，4℃15分钟）获得的上清液进行硫酸铵分级分离，并将50-70％硫酸铵沉淀的级分溶解在45ml缓冲液A中。将蛋白质溶液应用于阴离子交换树脂Resource Q用含有0.2M NaCl的缓冲液A平衡过的柱（6ml）（Amersham Biosciences，Buckinghamshire，英国），用线性梯度0.2-0.5M NaCl洗脱。收集含有GlcNAc ₂脱乙酰酶活性的级分并使用Ultrafree-4离心过滤器单元Biomax-30（Millipore，Bedford，MA）浓缩。然后将样品上样至用缓冲液B（50mM Tris-HCl [pH8.0]，150mM NaCl）平衡的凝胶过滤Superdex-200 HR 10/30柱（Amersham Biosciences）。收集的活性级分用缓冲液C（20mM Tris-HCl [pH7.5]）透析并施加到阴离子交换Mono Q HR 5/5柱（Amersham Biosciences）上。蛋白质用线性梯度0.2 -0.5M NaCl。在Mono Q柱后以1.5M的终浓度将硫酸铵加入到活性级分中，并将样品施加到用1.5M硫酸铵在50mM Tris-HCl中平衡的疏水性Resource ISO（1ml）（Amersham Biosciences）缓冲液（pH8.0）。蛋白质用1.5-0.5M硫酸铵的线性梯度洗脱。将活性级分合并，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后的活性染色。用Bio-Rad蛋白质测定系统（Bio-Rad，Hercules，CA）用牛血清白蛋白作为标准测定蛋白质浓度。

活性染色。通过使用荧光底物4-甲基伞形酮N-乙酰-beta;-D-氨基葡糖苷（GlcNAc-4MU，Sigma，St.Louis，MO）在非变性十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）与来自T.kodakaraensis的重组beta;-D-氨基葡萄糖苷酶（Tk-GlmA）（9）作为偶联酶。将与2times;样品缓冲液混合的蛋白质样品应用于12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶，而没有事先煮沸。电泳后，将凝胶用100mM Tris-HCl（pH8.0）冲洗20分钟，然后在反应缓冲液（100mu;MGlcNAc-4MU，100mM Tris-HCl [pH8.0]）中室温浸泡30分钟。将含有Tk-GlmA的凝胶（10nM重组Tk-GlmA，12.5％丙烯酰胺，0.33％N，N-亚甲基双丙烯酰胺，100mM Tris-HCl [pH8.0]，0.25％铵过硫酸盐，0.05％N，N，N，N-四亚甲基二胺），并且在凝胶双层在70℃温育5至15分钟后，在透照仪（312nm）上观察荧光带。通过491cLC型蛋白质测序仪（Applied Biosystems，Foster City，CA）测定活性蛋白质的N-末端氨基酸序列。

DNA操作和测序。 如Sambrook和Russell（10）所述，通过标准方法进行DNA操作。 限制酶和其他修饰酶购自Takara Shuzo（Kyoto，Japan）或Toyobo（Osaka，Japan）。 用Qiagen Plasmid Mini试剂盒（Qiagen，Hilden，德国）从大肠杆菌细胞中小规模制备质粒DNA。 使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit V3.0和3100型毛细管DNA测序仪（Applied Biosystems）进行DNA测序。

表达质粒的构建。 如下所述通过PCR构建Tk-dac的表达质粒。 两个寡核苷酸（正义，5-TCGGCCATGGTGTTTGAGGAGTTCAAC-3;反义，5-GCGGATCCAGAGAGGTACAG-3[加下划线的序列分别表示有义引物中的NcoI位点和反义引物中的BamHI位点]）和T.kodakaraensisgenomic DNA 分别用作DNA扩增的引物和模板。 扩增的DNA用NcoI和BamHI消化，然后与质粒pET-15b中的相应位点连接。 通过DNA测序确认了插入物中未预期的突变。 所得质粒被命名为pET-dac。

重组Tk-Dac的纯化。诱导含有pET-dac的大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL细胞用中等指数生长期的0.05mM异丙基-beta;-D-硫代半乳糖吡喃糖苷过表达，并在37℃下再温育3小时。通过离心（5,000xg，4℃下15分钟），再悬浮缓冲液D（50mM Tris-HCl [pH 7.5]，1mM EDTA）收集细胞，然后通过超声破碎。离心后的上清液（14,000times;g，30分钟）在80℃温育20分钟并离心（14,000times;g 15分钟）以获得热稳定的蛋白质溶液。将溶液用于70％饱和度的硫酸铵沉淀，将得到的沉淀溶解于缓冲液E（50mM Tris-HCl [pH8.0]，1mM EDTA）中的1.3M硫酸铵中。通过离心除去不溶性蛋白质（28,000xg在4℃下孵育15分钟），并将上清液应用于在缓冲液E中用0.9M硫酸铵平衡的疏水性Resource ISO柱（6ml）（AmershamBiosciences）。蛋白质用线性梯度为0.9-0.45M硫酸铵，并使用Ultrafree-4离心过滤器单元Biomax-10（Millipore）浓缩在0.65M硫酸铵上洗脱的峰级分。将其用于用缓冲液B平衡的凝胶过滤Superdex-200 HR 10/30柱。将峰部分相对于缓冲液C透析并施加到阴离子交换Mono Q HR 5/5柱上。用0.2-0.5M NaCl的线性梯度洗脱蛋白质，峰级分用10mM Tris-HCl（pH7.5）透析并在4℃保存。

酶的分析。 剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

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