工程荧光聚（多巴胺）胶囊外文翻译资料

工程荧光聚（多巴胺）胶囊

摘要：聚（多巴胺）（PDA）胶囊最近的发展为其在生物学和医学上的应用提供了新的机会。为了促进PDA胶囊在生物医学的应用，使荧光标记的PDA(F-PDA)胶囊的制备可能的战略是必需的，因为通过一系列基本荧光技术这将允许评估其细胞间的相互作用。在此，我们报告一种F-PDA胶囊制备简便的方法，通过在过氧化氢(H2O2)存在下牺牲模板上多巴胺（DA）的聚合。F-PDA胶囊定义尺寸通过不同的有机和无机颗粒模板来制备。结果表明F-PDA胶囊在HeLa细胞中的细胞毒性在孵育48小时后可忽略不计。我们也证明了利用常规荧光显微镜在HeLa细胞进行内化F-PDA胶囊可视化，生物的相互作用走向详细调查。

引言：聚（多巴胺）（PDA），由多巴胺（DA）的氧化聚合形成，是一个著名的在生物体的许多部分黑色素的生物聚合物。通过模仿贻贝粘附蛋白，Messersmith和同事们开创了一个简单而灵活的在碱性溶液中DA聚合到有机与无机基质的表面改性方法，包括贵金属、氧化物、聚合物、半导体、陶瓷。所获得的PDA表面涂层是通过希夫碱的形成或迈克尔加成对胺和巯基反应，它提供了一个简单的方法用各种功能分子修饰表面。另外，在聚合过程中功能性分子可以被纳入PDA结构，允许具有不同的反应性和物理化学性质的混合涂层的制造。

PDA涂层的优点在于它们的多功能性，如控制其厚度，表面化学，和良好的生物相容性。基于PDA的聚合物胶囊已经由模板组装制备，这是一个对工程纳米结构有吸引力的方法。一些颗粒模板已被使用，包括多孔二氧化硅粒子和乳化液滴。最近，这些PDA胶囊生物学研究报道；例如，亚微米大小的PDA胶囊已经用来固定阿霉素通过pH值不稳定的连接器，而这些载药PDA胶囊在体外癌细胞的有效的细胞内的药物释放。在生物系统中追踪PDA胶囊物的流动性将为药物载体的安全性和有效性提供重要的见解。然而，PDA作为已知的荧光猝灭剂，使PDA胶囊荧光标记复杂化。

要调查的PDA胶囊与生物系统的相互作用，重要的是要克服这种标签的挑战。最近，我们用含巯基的聚（甲基丙烯酸）聚合物共轭的Alexa Fluor 488染料作为链接标签PDA胶囊。虽然聚合物minus;染料结合物减少PDA对荧光猝灭的影响，但是交联和共轭标记的方法需要多个步骤来限制标记效率。最近的一项研究报道，在过氧化氢（H₂O₂）存在下，多巴胺的氧化处理产生荧光沉淀。这个发现启发我们寻求制备荧光PDA(F-PDA)的另一种方法，将上述氧化处理工艺与PDA胶囊模板组装结合起来。

在此，我们报告一个通过模板组装产生F-PDA胶囊的方法，消除与染料分子的共轭的需要。通过模板上的DA聚合和随后的核心去除合成PDA胶囊。结果PDA胶囊作为DA和H₂O₂的额外处理模板，导致F-PDA胶囊合成（方案1）。F-PDA胶囊的大小可以通过使用不同尺寸的模板来控制。我们发现F-PDA胶囊的荧光有pH依赖性的，最高的荧光观察在pH值为3。此外，这些F-PDA胶囊在培养48h后表现出可以忽略不计的HeLa细胞的细胞毒性。

方案1. F-PDA胶囊的合成示意图

通过第一次聚合，用PDA薄膜涂覆各种模板颗粒。模板去除后获得PDA胶囊。第二个PDA涂层，包括DA的二次聚合和随后与H₂O₂的反应，产生了F-PDA胶囊。

实验部分

材料 二氧化硅（SiO2）颗粒（直径1.1或2.5mu;m）和聚苯乙烯（PS）颗粒（D = 3.55mu;m）均购自Microparticles GmbH。碳酸钙（CaCO3）颗粒（D = 5.5mu;m），根据Imai等人报道的协议合成。盐酸羟酪胺（多巴胺），氢氟酸（HF）、氟化铵（NH₄F）、四氢呋喃（THF）、乙二胺四乙酸（EDTA），磷酸盐缓冲液（PBS），和3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)从Sigma-Aldrich获得。三（羟甲基）氨基甲烷（Tris），乙醇，磷酸钠(Na₂HPO₄),和柠檬酸一水化物购自Chem-Supply（澳大利亚）。从Na2HPO4和柠檬酸的混合溶液中制备通用缓冲液。通过调整体积比，制备pH值3和8之间的缓冲液。过氧化氢水溶液（30%（W / W）在水中）是用于在F-PDA胶囊的合成氧化实验。在所有的实验中使用的高纯度的（Milli-Q）水由Millipore公司的 Milli-Q水净化系统在电阻率大于18MOmega;·cm制备的。

F-PDA胶囊的合成 10毫克的模板颗粒（3.55mu;m PS，5.5mu;m碳酸钙，1.1mu;m二氧化硅或2.5mu;m二氧化硅）和20毫克的DA被添加到50毫升的10 mM的缓冲液中（pH= 8.5）。悬浮液不断搅拌在室温下过夜形成PDA的核心minus;壳粒子，其次是在三离心过滤/再分散循环用新鲜的Tris缓冲液洗涤。用THF去除PS颗粒，用0.2 M EDTA溶液去除碳酸钙颗粒，和用2M HF/8M NH4F溶液（HF）在pH值为5时去除SiO2粒子来去除模板粒子后得到的PDA胶囊。[谨慎！HF溶液毒性高。在处理HF溶液时，应特别小心，只有少量的准备。] 结果PDA胶囊悬浮在10毫升的Tris缓冲液（pH 10.5）和浓度为5毫克每毫升的DA溶液中允许反应60分钟。随后，2.5 mL H₂O₂加入混合并允许反应15 h。得到的F-PDA胶囊用Milli-Q水通过离心/再分散循环冲洗三次。

细胞培养 Hela细胞培养在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中用GlutaMAX supplement (Gibco)含10%胎牛血清在37℃在5% CO₂湿润的气氛中和用胰蛋白酶在汇合前传代培养。

MTT比色法 HeLa细胞接种在96孔板密度为每孔2times;104细胞。细胞在37℃在5% CO₂气氛下在200mu;L的悬浮液加入含有1.1mu;M F-PDA胶囊后（来自二氧化硅模板）在各种细胞与胶囊比率：1:0, 1:10, 1:25, 1:50, 和 1:100孵育48小时。板在37℃中介质被替换为200 mu;L 含MTT的培养基（最终浓度为0.5mg mLminus;1）后被进一步培养2小时。加入150mu;L增溶的混合物（0.04 N盐酸异丙醇）后，用酶标仪（Multiskan Ascent, Thermo Scientific）测量波长为560 nm的蓝甲的吸光度。未处理的细胞的吸光度值被设置为100%，和细胞增殖表示为未经处理的细胞的百分比。

细胞固着和染色 HeLa细胞接种于8孔Lab-Tek I腔室盖玻片(Thermo Fisher Scientific, Rochester)每孔2times;104细胞，允许附着一夜。细胞在1:100细胞胶囊比和37℃在5% CO2气氛下培养F-PDA胶囊24小时。在此之后，细胞用PBS洗三次，在室温下用4%多聚甲醛固定30 min。核和膜用Hoechst 33342（2mu;g mLminus;1）和Alexa Fluor 488小麦胚芽凝集素（5mu;g mLminus;1）染色，分别用标记试剂在25℃孵育细胞30分钟。

表征方法 扫描电子显微镜（SEM，FEI Quanta 200）和透射电子显微镜（TEM，Philips CM120 BioTWIN，操作在120 kV）用来观察胶囊形貌。胶囊在配备有异硫氰酸荧光素（FITC）过滤立方体的Olympus IX71倒置荧光显微镜中成像。利用包括450瓦氙弧灯的Fluorolog荧光分光光度计(Horiba)测定了胶囊的荧光强度。利用配备了60times;1.52钠油目的和标准的FITC / TRITC（激发555plusmn;14 nm，辐射617plusmn;37 nm）过滤器设置的反卷积荧光显微镜(DeltaVision,Applied Precision)获得了细胞图像。反卷积荧光显微图像用Imaris（Bitplane）进行处理。使用Nanodrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)定量悬浮在Milli-Q水中的F-PDA胶囊的紫外minus;可见吸收光谱。胶囊计数是在一个CyFlow Space流式细胞仪（Partec公司）进行。用Mettler-Toledo MP220pH计测量溶液的pH值。

结果与讨论

F-PDA胶囊的制备 有机（PS）和无机（SiO2和CaCO3）模板颗粒被用来合成F-PDA胶囊（方案1）。使用不同的模板制备的F-PDA胶囊的TEM，SEM，和荧光显微镜图像如图1（SiO2），图S1A，B（PS），而图S1C，D（碳酸钙）。通过改变模板尺寸（D = 1.1和 2.5mu;m）可以分别得到不同尺寸的单分散F-PDA胶囊，他们的荧光性通过使用带有异硫氰酸荧光素过滤器的标准的光学荧光显微镜（激发555 plusmn; 14 nm）证实了可视化（图1C、D）。所有的方法表明，个别胶囊除去模板后保留其大小和球形形状。该F-PDA胶囊壳的厚度（采自1.1mu;m SiO2）由60 plusmn; 10 nm的透射电镜确定（插图，图1B）。值得注意的是，一个F-PDA层没有第一个PDA涂层也可以直接形成于原始模板粒子；然而，没有第一个PDA涂层，得到的微胶囊在去除模板后具有机械强度差、不产生稳定的独立的胶囊。此外，在二氧化硅模板的情况下，与用HF去除模板处理导致的F-PDA胶囊与F-PDA核心minus;壳粒子相比荧光强度明显下降（图S2）。在这两个发现的基础上，我们通过在预先成型的PDA胶囊上形成荧光涂层来制备F-PDA胶囊，如图1所示。

图1.（A）扫描电镜，（B）透射电镜，（C）使用1.1mu;m直径的SiO2颗粒制备的F-PDA胶囊的荧光显微镜图像。嵌入在（B）显示，一个在高倍镜下的F-PDA胶囊。（D）使用2.5mu;m直径的SiO2颗粒制备F-PDA胶囊的荧光显微镜图像。

F-PDA胶囊的荧光性质 为了确定F-PDA胶囊的最佳激发波长，测定F-PDA胶囊的紫外minus;可见吸收光谱。F-PDA胶囊表现出广泛的吸收，从350到600纳米（图S3）。基础广泛的吸收（350minus;600 nm）预计是由于在囊壁PDA的存在。广义单调的吸收光谱是PDA和合成黑色素的特点，虽然对这种独特的吸收行为的确切原因是文献辩论。此外，紫外minus;可见吸收光谱也表现出肩峰在350minus;400 nm，这可以归因于在溶液中形成的荧光物种的存在，这是在氧化处理过程中结合（无论是共价或非共价）到PDA薄膜上。在400 nm处F-PDA胶囊的悬浮液激发导致在480 nm荧光发射。此外，该F-PDA涂层工艺上清液在400 nm激发时，在480 nm处具有强的荧光性（图S4）。在对照实验中，PDA胶囊在没有添加DA情况下进行H₂O₂处理。与DA和H₂O₂处理的PDA胶囊相比，只有H₂O₂处理的胶囊反应不显示荧光（图S5）。这些结果支持这一假设，F-PDA胶囊荧光的产生是由于在DA与H₂O₂之间反应在溶液中形成的小荧光分子的掺入，而不是修改现有的PDA薄膜。

接下来，我们试图通过改变第二大DA聚合步骤和随后与H₂O₂氧化的反应时间优化的F-PDA胶囊的荧光性。为DA聚合（15，30，60，180，和240分钟）和H₂O₂氧化（5，10，15，20，和30小时）的步骤选择不同的反应时间。第二次DA聚合时间为60分钟（图2A）和随后的与H₂O₂的氧化15 h（图2B）取得了F-PDA胶囊的最大荧光强度。在较长的反应时间（＞15小时），观察到的F-PDA胶囊荧光强度下降。明显，强氧化剂如高碘酸盐和碱性H₂O₂已被报道分别化学降解PDA和黑色素。因此，用DA/ H₂O₂过多处理F-PDA胶囊可能导致F-PDA结构氧化降解和失稳，导致荧光强度损失。

对F-PDA胶囊的pH依赖性进行了研究。F-PDA胶囊悬浮在不同pH值的缓冲液中，测定其荧光强度。荧光强度从高到低，是pH=3 gt; pH=8gt; pH=4 gt;pH=6 gt;pH=7 gt; pH 5（图3A）。在pH为3,6,或8的溶液中F-PDA胶囊也通过具有相同曝光时间和灯功率的荧光显微镜直接比较成像。最亮的F-PDA胶囊在pH为3的溶液中观察到的，与pH值为6相比，在pH值为8有稍高的荧光强度（图3Bminus;D）。有趣的是，从DA / H₂O₂处理过程观察不同的pH依赖性（pH值3minus;8）的上清液。荧光强度随pH的增加而增加（图S6）。这表明在上清液中的荧光化合物在聚合过程中与PDA表面进一步反应，从而产生不同的荧光部分。然而，由于DA聚合的复杂性，精确的化学反应和所得到的荧光的pH依赖性的说明仍然未知。

图2. 正常的发射光谱从1.1mu;m直径的SiO2粒子采用不同反应时间制备F-PDA胶囊：（A）改变第二DA聚合时间，保持H₂O₂反应时间常数在15小时和（B）改变H₂O₂的反应时间，保持第二DA

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