通过茉莉酸甲酯诱导酸浆中生物活性物质： 化合物积累模式和生物合成相关基因的候选外文翻译资料

通过茉莉酸甲酯诱导酸浆中生物活性物质：

化合物积累模式和生物合成相关基因的候选

Xiaori Zhan· Xiujun Luo· Jinyu He· Chengchao Zhang· Xinyue Liao· Xinyun Xu · Shangguo Feng ·

Chunna Yu· Zhifang Jiang · Yijun Meng· Chenjia Shen· Huizhong Wang· Jiangjie Lu

摘要：苦蘵是一年生茄科植物，具有多种药用活性成分。尽管苦蘵具有潜在的药用价值，但由于缺乏有关这种植物的基因组信息，限制了对其生物活性成分和生物合成机理的研究。为了促进对其主要化学成分生物合成途径的基本理解，我们采用代谢组学和转录组学的方法来揭示这些基因，与茉莉酸甲酯处理下生物活性化合物的生物合成有关。非靶向代谢组分析表明，大多数酸浆苷、黄酮类化合物和绿原酸均显著上调。靶向高效液相色谱/质谱分析证实了两种重要的代表性类固醇衍生物（酸浆素B和G的含量变化），茉莉酸甲酯处理的植物和对照的总黄酮、新绿原酸和绿原酸之间的差异。部分类固醇生物合成、黄酮类生物合成和绿原酸生物合成相关基因转录水平上调，为茉莉酸甲酯诱导苦蘵生物活性成分的合成提供了可能。系统的相关分析发现了许多与生物活性化合物合成相关的新候选基因，这些结果可能有助于阐明茉莉酸甲酯诱导活性化合物积累的调控机制，为进一步的功能研究提供一些有价值的候选基因。

关键词：绿原酸； 类黄酮； 酸浆素； 酸浆； 茉莉酸甲酯； 内酯类

介绍

苦蘵是茄科酸浆属的重要成员，是热带和温带地区广泛分布的草本植物。根据该植物对人体健康已证实的有益作用，它作为一种重要的经济作物在中国很多地区种植。在传统药物中用于治疗发热、糖尿病、咽炎、疖肿、咳嗽、乳腺炎等，具有抗菌消炎抗癌等高商业价值。近年来，酸浆属植物因其先进的分析化学技术而越来越受到植物化学和药理研究的关注，其化学成分包括169个醇内酯类化合物、15个蔗糖酯类化合物、14个黄酮类化合物，5个普通二萜，3个神经酰胺和10个其他化合物（如绿原酸）。然而，这些生物化合物在酸浆属中的生物合成和代谢途径尚未确定。

酸浆内酯类化合物是酸浆属植物中最常见的成分，其重要的药理学研究集中在抗肿瘤、抗应激、免疫抑制、抗微生物和抗炎活性方面。苦蘵是第一个被分离和建立的环状甾体结构化合物，通过调控p38 MAPK/ROS通路和抑制JAK/STAT3信号通路诱导人非小细胞肺癌细胞G2/M期细胞周期阻滞。酸浆素 B通过增强p53依赖的凋亡通路，诱导乳腺癌细胞周期阻滞并触发细胞凋亡。酸浆素 D表现出多种生物活性。酸浆素 E通过靶向NF-kappa;B信号通路抑制炎症细胞因子的产生。酸浆素 F通过靶向NF-kappa;B和产生活性氧诱导人肾癌细胞凋亡。酸浆素 H的免疫抑制活性归因于其抑制t细胞的激活和增殖。随着癌症发病率的增加，对酸浆素s的需求也会增加。

乙烯内酯的化学性质已经得到了深入的研究，并被归为一类甾体内酯。用于内酯类生物合成的两个C5异戊二烯单元来自于异戊烯基二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP），它们是通过MVA和MEP途径提供的。在植物中，细胞质和线粒体萜类前体通过MVA途径合成，塑料萜类则通过MEP途径合成。C-30羊毛甾醇是第一个中间体，一系列的酶和其他因子被证实参与了类固醇的生物合成和代谢。

类固醇的核心环单元是由氧化角鲨烯环化，产生的角鲨烯合成酶是一种内质网膜酶，可将两个单位的法尼酰二磷酸前体转化为角鲨烯。环烯醇合成酶(CAS)是一种氧化角鲨烯环化酶，催化甾醇路径的关键步骤。

羊角甾醇合成酶（LAS）与CAS有亲缘关系，与CAS系统发育相关，在植物固醇稳态中发挥作用。

固醇类24-c-甲基转移酶(SMT)属于单碳转移甲基转移酶家族，对类固醇的生产至关重要。此外，甲基甾醇单加氧酶2(SMO2)、3B-HSD、3-b-羟基甾体-delta(8)、A(7)-异构酶(HSI)和环戊烯醇。
环异构酶(CPI)也被报道参与甾体的生物合成。然而，随后的参与内酯生物合成的步骤，特别是24-亚甲基胆固醇还没有确定。在酸浆属植物中鉴定出14种黄酮类化合物。苦蘵黄酮类化合物的抗疟活性在体内对寄生虫病表现出良好的抑制作用。以及一种新型的细胞毒性类黄酮苷对小鼠白血病细胞株P-388表现出显著的体外细胞毒性，类黄酮生物合成途径已在植物中进行了深入研究。作为类黄酮生物合成的起始步骤，在苯丙氨酸解氨酶(PAL)的控制下将氨基酸苯丙氨酸转化为反式肉桂酸。查尔酮合成酶(CHS)催化第一个合成黄酮类化合物查尔酮的关键步骤。然后查尔酮异构酶(CHI)催化查尔酮转化为柑橘素，黄酮3-羟化酶(F3H)和类黄酮3-单加氧酶(F3′M)参与花青素的代谢和积累。绿原酸虽然不是酸浆素植物中的主要化合物，但作为木质素生物合成中的一种苯丙化合物，绿原酸是咖啡酸和D-奎尼酸的酯，是莽草酸途径提供的必需前体。对绿原酸在体内对糖尿病的治疗作用也进行了全面的研究，
代谢组学和转录组学分析已在酸浆属植物中得到应用。2012年，Marintilde;o-Ramiacute;rez 和colleagues出版了第一本《酸浆转录》第二卷第二页共鉴定出21191个假定的功能基因。利用转录组数据，我们在Physalis peruviana 发现了许多与免疫相关的基因。利用RNA-seq法对Physalis alkekengi 和P.peruviana 的叶组织进行了区分。从被尖孢镰刀菌感染的P. peruviana植物中鉴定了几个推定的影响基因。以核磁共振为基础的P. peruviana果实代谢研究表明其植物化学成分在不同生长区域中存在显著差异。代谢组学揭示了几种可能的代谢物，可区分有机的和传统的P. peruviana果实。然而，完全代谢参与活性成分生物合成的途径在苦蘵中尚未确定。

茉莉酸甲酯是一种重要的植物激素，广泛应用于不同植物组织器官的治疗，有效的筛选参与合成生物活性化合物的新基因，用作激发子以促进类固醇的积累。

本研究建立了根癌农杆菌介导的毛状根系统，以提高类固醇生物活性的积累。对差异表达基因的分析有助于阐明茉莉酸甲酯诱导生物活性化合物积累的调控机制，并为进一步的功能研究提供一些有价值的候选基因。

材料和方法

植物和毛状根系
本研究采用F6代人工自交的角叶松株系HNPA0002。将HNPA0002幼苗种植在光周期为12h光/12h暗、相对湿度为60%、光照强度为-2的生长箱中、120mu;mol m^minus;2 s^minus;1。选用2周龄幼苗的幼叶生产毛状根。在外植体侵染方面，用发根农杆菌C58C1培养HNPA0002的毛状根。根据我们之前的研究建立了苦蘵毛状根系，将HNPA0002的毛状根培养3周后，置于装有50mL Murashige和Skoog液体培养基的锥形培养皿中，在25°C下避光，取1g新鲜毛状根作进一步处理激素处理采用100M 茉莉酸甲酯乙醇溶剂，接种HNPA0002毛状根6d。用乙醇接种毛状根作为对照每个样品的一半用于RNA提取，另一半在40°C烘干用于代谢物提取。实验生物重复3次用于RNA-seq分析，15次用于代谢物分析。

代谢物提取

冻干的组织样本被磨成粉末，通过40目筛子过滤，用于代谢研究。在每个样品中加入1毫升甲醇(每个样品约含有100mg)，通过涡流充分混合1分钟。然后在冰浴中超声20分钟，以13000rpm离心4°C持续20分钟。将上清液(200L)转移到取样器小瓶中进行代谢物检测。
诸多代谢组分析
LC-MS分析使用安捷伦1290 Infinity II UHPLC系统和安捷伦6545 UHD和DF/MS系统。色谱分析采用Waters XSelect HSS T3色谱柱(2.5um 100x2.1mm)。流动相为A(含0.1%甲酸水溶液)和B(含0.1%甲酸乙腈溶液)。其他参数设置如下:流量0.35mL/min,温度25摄氏度，注入体积2L,优化梯度洗脱条件的5%,0-2分钟,95%的B 13-15分钟,5分钟的洗脱时间维持系统的平衡。
质谱(MS)数据在正离子和负离子模式产生。优化后的MS参数设置为:正模式毛细管电压4kV,负模式毛细管电压3.5kV,干燥气体流量10L/min,气体温度325C,雾化器压力20p,破碎器电压120V,刮板电压45V, m/z范围50-1500。在质谱数据采集过程中使用参考离子，以保证质量的准确性。正离子模式下参比离子分别为121.0509和922.0098，负离子模式下参比离子分别为112.9856和1033.9981。用碰撞能量为10V的MS/MS进一步定量差异积累代谢物(DAM)，分别为20v和40V。

非靶向代谢组数据集的生物信息学
原始数据格式转换采用安捷伦Mass-Hunter定性分析B.07.00软件。基于R平台的XCMS程序用于离子峰识别、保留时间校正和自动集成。数据归一化后，显示样本名称、m/z对、峰面积等重要信息。内标样品是所有个体样品的混合物，准备用于非靶向渐变分析。软件metaX tas用于预处理原始峰值强度数据。首先，去除质量控制(QC)样本中小于50%或实验样本中小于20%的特征。然后通过去除30%相对标准偏差的特征进行过滤这些特征在所有内标样品中计算。所有高数量的数据矩阵均以均值为中心，并使用SIMCA-P 13.0软件，最后进行多变量分析。

黄酮和绿原酸的测定
将酸浆素B和G标准品溶于甲醇溶液中，配制10mg/mL原液。制备浓度为1ug/mL的异拉西丁溶液作为内标。将酸浆素B和G的原液稀释至8-10倍浓度以建立校准曲线。酸浆素B和G标准品的质谱见附加文件1。以冻干样品粉25mg进行定量。首先，将1ml异拉西丁甲醇溶液(20%)加入有样品粉末的管中。在25°C下超声提取代谢产物30min,收集上清。12000xg离心10min,0.22um滤池过滤。最后，将1L过滤后的样品溶液注入超性能LC

-electrospray(UPLC-ESI)MS/MS系统中进行质谱分析。采用Acquity UPLC BEH Shield RP C18柱。流动相的成分如我们之前的研究中所述。MS/MS分析参数设置如下:喷雾电压5.5kV;源温100°C;帘内氮气压力为20-55psi;入口电位10V;碰撞单元10V。

采用硝酸铝比色法测定总黄酮含量，以芦丁为标准。简单地说，冷冻样品用75%乙醇在37°C下提取20min，细胞碎片在12000xg下离心10min,测定上清中总类黄酮含量。将含5%纳米和10% Al(NO₃)₃ 的混合溶液加入.上清液中，用添加4%的氢氧化钠。吸光度测定波长为510nm。
测定绿原酸时，冷冻样品均质于70%甲醇中。首先，溶液通过0.22um的膜过滤。然后，在高性能(HP)LC系统中注入10uL。HPLC分析参数设置:检测波长320nm;0.2%乙酸为溶剂A，甲醇为溶剂B;流速为1mL/min。溶剂洗脱图设置 如下:90% 0分钟,85%溶剂为5分钟,74%溶剂为30分钟 ,65%溶剂40分钟,溶剂为45分钟,0%,溶剂90% 50分钟。新绿酸和绿原酸的质谱标准如附件2所示。

RNA的提取和cDNA文库的制备

总RNA采用RNeasy plant mini kit 按照制造商的协议提取。然后，用oligo(dT)珠分离纯化带有poly (A) tail的mRNA。将mRNA用二价阳离子在95°C条件下随机分割成小片段，以随机六聚体引物为模板合成 cDNA。RNaseI处理后，用DNA聚合酶I合成第二链cDNA。纯化后的cDNA片段然后按照协议与测序适配器连接。PCR扩增后，经琼脂糖凝胶电泳得到 300-500 bp的目的片段，建立cDNA文库。

测序、组装和注释

按照供应商推荐的方案，在LC- Bio的Ilumina Hiseq 4000上用2x100 bp进行RNA-seq。原始读取通过删除排序适配器进行过滤，并使用Cutadapt软件和内部Perl脚本进行低质量和未知碱基读取(Martin 2011)。使用FastQC在线工具验证了Q20、Q3和GC含量等序列质量参数。高质量的Reads被视为clean Reads。使用Trinity 2.4.0软件对所有的干净序列进行重新组装，生成参考转录组。

转录组数据集的生物信息学

本试验采用3个独立的生物重复。利用Samlon程序，采用百万分之标签法计算基因表达水平。按照log2(fold change)gt;1或log2(fold change)lt;-1筛选差异表达基因(DEGs)，差异有统计学意义(P值lt;0.05)。然后，根据我们以前的公开工作，对DEGS进行GO和KEGG富集分析。

DEGs与DAMs的相关性分析

采用Pearson相关分析评价DEGs与大坝之间的相关性，筛选标准:相关系数IR|gt; 0.99, Plt;0.001。利用Cytoscape软件绘制了DEGs与坝之间关系的网络图。

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