不同耐盐基因型籼稻在盐胁迫下的抗氧化酶活性及蛋白质谱分析外文翻译资料

不同耐盐基因型籼稻在盐胁迫下的抗氧化酶活性及蛋白质谱分析

原文作者 Vinay Kumar，Varsha Shriram，T.D.Nikam，Narendra Jawali and Mahadeo G.Shitole

摘要：以3个水稻栽培品种(cvs)、Panvel-3(耐盐)、Kalarata(中度耐盐)和Karjat-3(盐敏感)为材料，研究了NaCl胁迫(0～300 mM)对抗氧化酶活性及其同工酶谱和SDS-PAGE蛋白条带的影响。有趣的是，在高盐浓度胁迫下，Karjat-3和Kalarata的根系超氧化物歧化酶活性和芽及根系的谷胱甘肽还原酶活性均显著降低，而panvel-3则显著升高。所有品种的过氧化氢酶和过氧化物酶活性随盐胁迫的增加而增加，其中panvel-3最显著。在盐胁迫下，Panvel-3和Kalarata中诱导出两种新的POX同工酶。有无盐胁迫，所有基因型中都观察到四种SOD同工酶。在NaCl胁迫下，共有33个分子量为17-154.5 kDa的蛋白质条带重新合成或上／下调。盐胁迫下，panvel-3的幼苗中出现了3个新的条带，32 kDa的条带出现在茎部，37和116.7 kDa的2个条带在根部。在盐分胁迫下，Kalarata中也观察到出现在根部的37 kDa新带。因此，Panvel-3的耐盐性可能与盐胁迫下更高的酶活性和一些新的多肽的表达有关。

关键词：同工酶；超氧化物歧化酶；过氧化氢酶；过氧化物酶；谷胱甘肽还原酶；籼稻；盐胁迫；盐胁迫蛋白

1引言

土壤和灌溉用水的高盐分是一种主要的非生物胁迫，严重影响着世界范围内的作物生产。一些热带和温带地区的水稻种植国家正面临土壤盐度高这一主要问题，干旱、半干旱和热带沿海地区受影响更大，因为这些地区的水稻土地普遍存在盐度高的情况。在印度，超过860万公顷的土地受到盐分影响，这是印度问题土壤的主要部分。水稻是印度最重要的作物，是印度65%以上人口的主食。尽管在提高植物生产力和对一些病虫害的抗性方面取得了进展，但作物耐盐性的提高仍然面临着困难的局面，这是因为植物耐盐是一个复杂的性状，通过渗透和离子胁迫在植株和细胞水平上影响了植物生理生化的各个方面。

植物盐胁迫的一个后果是活性氧(ROS)／中间产物的过度产生，如超氧化物自由基(O₂^·-)，过氧化氢(H₂O₂)以及羟基自由基(OH^-)。在叶绿体中，ROS可通过叶绿素直接转移激发能产生单线态氧或在Mehler反应中通过光系统I的单价氧还原产生。Vaidyanathan等人认为，盐胁迫期间ROS的过量产生是由于叶绿体和线粒体的电子传递过程受损以及光呼吸等途径所致。ROS的过量产生会破坏细胞膜和其他重要的生物大分子，如光合色素、蛋白质、DNA和脂类，并且在抑制光合作用中发挥重要的作用。

然而，植物已经进化出了多种耐盐机制以应对盐胁迫的危害，包括酶和非酶抗氧化机制。几种抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POX)以及谷胱甘肽还原酶(GR)参与ROS的清除。这些抗氧化系统可分为两类：一类与活性氧反应并保持在低水平(POX、SOD和CAT)，另一类能使氧化的抗氧化剂再生的抗氧化剂(抗坏血酸过氧化物酶[APX]和谷胱甘肽还原酶)。有足够的证据表明，减轻氧化损伤和增加耐盐性往往与植物中有效的抗氧化防御系统相关。

此外，盐分对植物的代谢产生不利影响，并导致植物基因表达的发生重要修饰。这种修饰可能导致某些代谢物的积累或消耗，从而导致细胞蛋白质水平的不平衡，在盐处理后，这些蛋白质可能增加、减少、出现或消失。在逆境条件下，植物组织中可能会合成和积累多种蛋白质，这些蛋白质被称为胁迫蛋白，因为很多种原因这些蛋白质的信息是很重要的，例如这些蛋白质的评估有助于揭示在盐胁迫下可能改变的基因数量，并且鉴定这些蛋白质标记物的胁迫耐受性可以为植物育种者提供一个简单的工具来分析耐盐性状，这反过来有助于产生耐盐基因型。近年来，研究盐胁迫蛋白在水稻耐盐性中的作用引起了人们的广泛关注。然而目前为止它们的功能仍然不明确。研究不同基因型在抗氧化防御系统和蛋白质改变方面的差异反应，并对比耐盐性，将有助于剖析潜在的耐盐机制。

本课题研究了不同盐浓度对不同基因型籼稻抗氧化酶活性及其同工酶分析和差异蛋白电泳图谱的影响，并对其非盐胁迫和盐胁迫条件下的耐盐性进行了对比。

2材料与方法

2.1植株材料与盐处理

本研究选择了三种籼稻(Oryza sativa L.)，即Karjat-3（盐敏感）、Kalarata（中度耐盐）和Panvel-3（耐盐）。Karjat-3种子来自印度马哈拉施特拉格尔杰德的地区水稻研究站，而Kalarata 和Panvel-3的种子来自印度马哈拉施特拉潘维尔的盐碱地研究站。

每个品种的20粒种子分别播种在与外界隔绝的（无开口）塑料花盆（15*15*12cm）中，以确保稳定的盐胁迫水平。花盆用10毫米筛网后的蛭石、沙子和花园土壤1:1:1)混合填充，放置在印度浦那大学植物系植物园。对植物进行灌溉以满足蒸腾需求，并在所有花盆中施用等量的水。播种后前14天用不含NaCl的水对植株进行灌溉，然后以50、100、150、200、250、300 mM NaCl为灌溉水进行6个浓度的盐胁迫处理，并在播种后第14天至第21天连续7天交替施用盐溶液来保持盐胁迫水平。除对照植物外，研究了不同盐浓度处理下的酶活性，并对100mM和200mM NaCl胁迫下的蛋白电泳谱和同工酶进行了分析。在播种后第21天进行观测记录，每组试验重复3次。

2.2提取以及抗氧化酶测定

通过记录酶对超氧化物-硝基蓝四唑(NBT)复合物产生的formazan吸光度的降低来估计SOD活性，此方法由Dhindsa等人提供。在预冷的研钵和研杵的帮助下，将新鲜的500 mg芽和根样品分别在0.1 M磷酸盐缓冲液(pH=7.5)中磨成匀浆。3 ml的混合反应物中含有0.1 ml 1.5M碳酸钠、0.2 ml 200 mM蛋氨酸、0.1 ml 3mM EDTA、0.1 ml 2.25 mM NBT、1.5 ml 100 mM磷酸钾缓冲液、0.95 ml蒸馏水以及从每个酶样品中取0.05 ml酶，一式两份于试管中。取两管无酶提取物作为对照。反应开始时，加入0.1 ml核黄素(60 mu;M)，将两只试管分别置于两个15 W荧光灯的光源下15分钟。关灯并用黑布盖住试管，反应停止。不含酶的试管呈现最深的颜色，将没有颜色的试管则作为空白管。在560nm处记录吸光度，以一个单位的酶活性作为酶量，使样品的吸光度读数比不含酶管降低50%。

CAT活性测定参照Luck。将新鲜的芽和根样品(250mg)在预冷的研钵和研杵中的帮助下，与3 mL 0.1 M磷酸盐缓冲液(pH=7)中磨成匀浆。将提取物在4℃以15000 g离心20分钟，并取上清液作为酶源。混合反应物中含有0.5 ml 0.2 M磷酸盐缓冲液(pH=7)、0.3 ml H₂O₂和0.1 ml酶，加入蒸馏水使最终体积为3 ml。实验在27plusmn;2℃下进行。加入酶开始反应，在240 nm处测定吸光度。

POX活性测定采用Putter的方法。新鲜的芽和根样品(250 mg)用预冷的研钵和研杵，在5 ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH =7.0)中磨成匀浆。将提取物在4℃以15000 g离心20分钟，并取上清液作为酶源。3 ml的混合反应物中含有1.8 ml 0.1 M磷酸盐缓冲液(pH=7.0)，1 ml新鲜制备的10 mM愈创木酚，0.1 ml酶提取物和0.1 ml的12.3 mM H₂O₂。在436 nm处读取初始吸光度，然后每隔30秒记录吸光度的增加。

GR活性测定参考Smith等人的研究方法，通过记录氧化谷胱甘肽和DTNB(5,5rsquo;-二硫双-2-硝基苯甲酸)的增加来测定GR活性。反应混合物中包含混有0.1 mM EDTA的0.2 M磷酸钾缓冲液(pH=7.5)1 ml，混有3 mM DTNB的0.01M磷酸钾缓冲液(pH=7.5)0.5 ml、0.1ml 2mM NADPH、0.1ml酶提取物，加入蒸馏水使最终体积为2.9 ml。在5min内记录412 nm处吸光度的增加。

2.3同工酶分析

采用Monokin电泳仪在4℃下用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶分离SOD同工酶。分别取对照与盐胁迫下的芽的蛋白质浓度50 mu;g加入到每个加样孔中，然后在30 mA下电泳2小时。SOD活性染色遵循Beauchamp和Fridovich的改进方法和根据Sandalio等人的抑制剂研究方法，以区分各种SOD异构体。将凝胶在含有1.23 mM NBT、0.02 mM核黄素、28 mM TEMED的50 ml 100 mM pH=7.5磷酸钾缓冲液中在黑暗中浸泡20 min后，然后在光源照射下以引发光化学反应。

CAT同工酶在10%非变性丙烯酰胺凝胶上分离，在30mA 4℃下电泳24小时，并遵循Woodbury等人的方法进行显色。将凝胶在双蒸水(DDW)中漂洗，然后在0.01%H₂O₂中温育5分钟，用双蒸水洗涤两次，然后在0.5%铁氰化钾和0.5%氯化铁的溶液中染色。条带形成后，用1%HCl终止反应。

POX同工酶的分离与染色按照Anderson等人的方法进行。用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶分离POX同工酶，4℃ 30mA150 min完成电泳。用50 ml含100 mM磷酸钾缓冲液、20 mM愈创木酚和5.55 mM H₂O₂的pH=6.4溶液对凝胶进行染色，观察POX的异构体。

2.4 用SDS-PAGE分离蛋白质

按照Leammli的方法，根据蛋白质的分子质量，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离根和芽的蛋白质。取新鲜植物组织(200 mg)于液氮中借助研钵和研杵磨成粉末，在1毫升冷磷酸盐提取缓冲液(pH=7)中磨成匀浆，10000 g、4℃离心15 min，将离心后的提取物立即置于-20℃保存。蛋白质的测定是参照Bradford法。取等量的蛋白样品与20 mu;l pH=6.8的样品缓冲液在eppendorf试管中混合，在100℃的热水中保存1 min使样品变性。在垂直电泳仪中，将20 mu;g蛋白质样品装入包含两层凝胶组成的加样孔中，上层为5%堆积胶，下层为12%(w/v)分离胶，其中包含0.1%SDS和10%硫酸铵。标记蛋白(Bangalore Genei,India)加入单独的加样孔中。凝胶用0.2%(w/v)硝酸银溶液染色，并储存在50%(v/v)甲醇中。凝胶图像分析使用的是凝胶成像系统一体机(Alpha Innotech Corporation,USA)，并通过软件包Alpha Ease FC 4.0计算多肽条带的分子量。

2.5数据统计与分析

实验重复三次以检查结果的可重复性，然后进行数据的统计分析。对数据进行方差分析(ANOVA)以检测平均值之间的显著性差异。使用邓肯氏(Duncan)新复极差法(DMRT)在plt;0.05时比较平均值之间的显著性差异。所有数据统计分析均由MSTAT-C统计软件包完成。

3结果与讨论

3.1NaCl胁迫不同水稻品种抗氧化酶活性及同工酶谱的影响

包括盐胁迫在内的非生物胁迫通过各种机制影响植物，除了诱导氧化应激外，还会引起离子失衡，渗透胁迫。本研究的目的是探究不同耐盐性水稻品种中活性氧清除机制的比较。这可能有助于阐明耐盐水稻品种用于对抗盐诱导的氧化应激的关键成分，另一方面可能有助于鉴定重要作物耐盐性的候选基因。因此，本研究报道了NaCl胁迫下水稻栽培品种Panvel-3、Kalarata和Karjat-3芽和根中重要抗氧化酶的活性和凝胶检测。

有趣的是，Panvel-3在对照和盐胁迫处理下的SOD活性显著高于Kalarata和Karjat-3。随着盐胁迫浓度的升高，所有栽培品种芽的SOD活性均显著增加，但各品种间的SOD活性增加速率差异很大。与非盐胁迫植物相比，Panvel-3的SOD活性增加了156%，Kalarata在此盐胁迫水平下的SOD活性增加了152%。与上述结果相反，Karjat-3在300 mM NaCl胁迫下，SOD活性的增加速率较低，在芽中增加了122%。

SOD是一种普遍存在的酶，在细胞对活性氧的防御机制中起着关键作用。其活性调节两种Haber-Weiss反应底物O₂^·-和H₂O₂的相对含量。它还能降低羟基自由基形成的风险，羟基自由基具有高度反应性，可能会对膜、蛋白质和DNA造成严重损害。对两种水稻的根

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