二氧化碳微泡流动Blasin浓度的降低可以抑制稻瘟病菌的萌发和附着胞的形成外文翻译资料

二氧化碳微泡流动Blasin浓度的降低可以抑制稻瘟病菌的萌发和附着胞的形成

原文作者 Tamaki Masahiko¹, Kobayashi Fumiyuki², Suehiro Keisuke¹, Ohsato Shuichi¹, Sato Michio¹

单位¹School of Agriculture, Meiji University, Kawasaki 214-8571, Japan

²Faculty of Applied Life Science, Nippon Veterinary and Life Science University, Musashino 180-8602, Japan

摘要：我们研究了减少Blasin流动液(BF)使用的可能性，BF是一种利用二氧化碳微泡(CO₂MMB)抑制稻瘟病菌孢子萌发和附着胞形成的消毒剂。减压式发生器产生的CO₂微泡(CO₂MMB)和气-水循环式发生器产生的CO₂MB相比，10000倍稀释的含CO₂MB的BF溶液对种子萌发有显著抑制作用。含CO₂MBs的10000倍稀释BF溶液中附着胞的形成小于CO₂MMB。扫描电镜观察到，用含CO₂MBs的5000倍稀释BF溶液处理的分生孢子表面有皱纹和凹痕。通过透射电镜，我们观察到含有CO₂MBs的BF溶液处理的分生孢子内液泡和细胞内空间的膨胀以及膨胀或缺失的脂粒。实验结果表明，利用解压型CO₂MB，可抑制稻瘟病菌分生孢子萌发和附着胞形成。

关键词：附着胞形成，Blasin可流动，萌发，稻瘟病菌，二氧化碳微泡

1. 介绍

稻瘟病是日本水稻栽培中最重要的病害。随着水稻种植技术的改进，日本每10英亩的水稻产量超过500公斤，而且盈余稳步增加。但是，在低温的夏季和稻瘟病爆发后可能出现产量亏缺。稻瘟病菌是引起稻瘟病发生的植物病原真菌；在气温较低、日照较差、雨量较大的时期生长稳定。随着芽管和含有隔膜的细胞壁下方的黑色素层的伸长，分生孢子在水稻表面有水存在的情况下萌发，并形成附着胞。菌丝从气孔或穿透细胞壁在植物中膨胀，在顶端产生几个分生孢子。因此，病变上的分生孢子向稻秆移动，影响稻秆和分枝，从而导致大多数水稻组织坏死。因此，稻秆缺乏营养，变白，导致产量显著下降。为了缓解这一问题，日本使用了化学杀虫剂水稻产量增加了。然而，富营养化是这一趋势的直接后果，农业地区的氮和磷浓度很高，从而影响到水生生物。由于消费者越来越意识到农药使用的负面影响，减少农药使用种植的水稻价格更高。

最近，直径小于50micro;m的小气泡，即“微泡”(MB)，在很多领域得到研究和应用。微泡的特性包括上升速度慢、自增压、高气体溶解度、高表面电位和坍缩产生自由基。在农业生产中，开展了甜瓜尖孢镰刀菌孢子和胡萝卜果核菌亚孢子的灭活研究。研究了臭氧微泡去除果蔬中胡萝卜菌和农药残留的效果;进一步的研究还研究了加压二氧化碳微泡的巴氏灭菌。此外，二氧化碳微泡产生的自由基与恶臭假单胞菌失活有关。此外，微泡增强了表面活性剂的清洁效果，尽管其潜在机制尚不清楚。在此背景下，我们研究了Blasinreg;流动液(BF)的使用情况，这是一种抑制稻瘟病的消毒剂。研究了含CO₂MB的BF溶液对水稻分生孢子萌发和附着胞形成的抑制作用;二氧化碳是一种无害、廉价的气体。此外，还用电子显微镜研究了含CO₂MB的BF溶液对稻瘟病菌分生孢子的影响。

2. 材料和方法

2.1. 米裂孢子悬浮液的制备

制备了稻瘟病菌分生孢子悬浮液，其中稻瘟病菌Hoku-1株(NBRC30736)来自日本川崎明治大学植物病理学实验室。将一部分含有P. oryzae Cavara的琼脂涂于燕麦琼脂上(OMA, 50 g燕麦，20 g蔗糖，20 g琼脂放入1 L蒸馏水中)，形成P. oryzae分生孢子琼脂，在30°C条件下黑暗培养20天。孵育后，将菌落置于近紫外黑光(300-450 nm, 10 W (50 Hz)，日本，东大阪，Tarutanidenki有限公司) 30 cm高度照射2-3天。辐照后，将14mL蒸馏水倒在平板上，用抹刀轻轻刮去平板表面。获得的用双层纱布过滤溶液，除去溶液中的菌丝和分生孢子。用托马斯计数室(血细胞计数器A4200。用蒸馏水制备浓度为6.0times;105孢子mL^-1。本文研究采用蒸馏水悬浮液中悬浮的稻瘟病菌分生孢子。根据以往的研究，蒸馏水、葡萄糖或蛋白胨溶液中附着胞形成率相似。

2.2. Blasinreg;流动液的制备

本实验采用日本东京北科化工有限公司BF溶液，分别用自来水稀释至1000 倍、5000倍、10000倍、50000倍。它含有15%的四氯苯酞和15%的嘧菌腙作为活性成分。四氯苯酞抑制病原体主要代谢途径的还原酶活性，阻断黑色素的生物合成，阻止病原体附着胞形成后的进展。嘧菌腙可以阻止病原菌将乙酸和吡啶酸运输到菌丝中，影响细胞膜功能，影响氢离子等酸性电解质的通透性。因此，菌丝的生长受到抑制，这是由于菌丝中酸性电解质的泄漏。

2.3. 用CO₂MB处理的BF溶液治疗稻瘟菌分生孢子

CO₂MB是由减压型(fs101 - l1oz;日本熊谷Fuki有限公司)及燃气水循环型(20NPD04S;Shigenkaihatsu有限公司,日本横滨)MB发电机在圆柱形容器(phi;31.0厘米times;61.0厘米,42 L)包含20 L的BF解决方案(20°C) 5分钟。这是定量证实四氯苯酞和嘧菌腙 BF解决方案的数量没有减少MB治疗(数据未显示)。为了比较，CO₂微泡(CO₂MMB)处理是通过使用空气石和泵注入CO₂进行的。采用pH计(D-51，堀田有限公司，京都，日本)测定了CO₂MB处理的BF溶液的pH值。将共1ml CO₂MB处理的BF溶液加入1.5 mL含有0.1 mL 稻瘟病分生孢子悬液的管中，用旋涡搅拌机搅拌。随后,10毫升将混合物放在聚碳酸酯板上，在20°C的高温下放置24小时。

2.4. 分生孢子孢子萌发率和附着胞形成率的测定

荧光显微镜(times;200,BZ-9000; 日本大阪凯因斯公司)。结果表明，聚碳酸酯板的萌发率和附着胞形成率最好。选用人工材料(数据未显示)中的稻瘟病菌作为接种材料。在各观察区域测定了总分生孢子数、萌发分生孢子数、萌发分生孢子数，这些分生孢子数在视觉上证实了芽管的伸长大于3mm，并测定了附孔形成分生孢子数。计算了萌发率和附着胞形成率，并给出了6个视野的均值和标准误差。

2.5. 稻瘟病分生孢子的电镜观察

利用电子显微镜观察稻瘟病分生孢子。将分生孢子暴露于经CO₂MMB和CO₂MBs处理的5000倍稀释BF溶液中5 min，同时将分生孢子暴露于5000倍稀释BF溶液中进行比较。随后，将处理后的稻瘟病分生孢子液1ml滴入1.5 mL管中，双离心(6000r min - 1,5 min)收集分生孢子，再悬浮于1/15 mol L^-1磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中。之后,解决方案是混合了25% 戊二醛溶液(关东大化工有限公司公司,东京,日本)(最终戊二醛浓度是2.5%),室温预固定1 h, 2% OsO4室温后固定1 h，再用50%、70%、80%、90%、95%、99.5%乙醇溶液脱水(乙醇溶液浓度用磷酸盐缓冲溶液设定)。采用扫描电镜观察:将脱水样品浸泡在t-丁醇和脱水乙醇的混合物中(1:1);10分钟后放入100%丁醇中，-20℃冷冻过夜。然后用冷冻干燥机(ES-2030，日立高科技公司，东京，日本)对样品进行冷冻干燥，并在真空条件下用OsO4涂膜机涂敷OsO4涂膜机10秒(涂层厚度调整为3 nm)。用扫描电镜在3kV下对样品进行观察。透射电镜观察结果如下:脱水的样本沉浸在Quetol-651的混合物(Cosmo生物有限公司,东京,日本)和乙二醇缩水甘油醚(1:1)和保存样本1 h。然后在混合物连续更换(2:1、3:1的比例)和100% Quetol-651和嵌入式60°C 48 h。超薄部分厚度(90海里)从嵌入式获得样本,使用一个超微切片机(超节点,徕卡微系统公司位于德国)。用4%乙酸铀酰溶液和硝酸铅溶液分别对切片进行12 min和5 min的双电应变，然后用透射电子显微镜 (JEOL jem - 2010有限公司)在140 kV下进行观察。

2.6. 统计分析

采用Tukey-Kramer检验比较差异的统计学意义(Plt;0.01)。

1. 结果

研究了不同浓度的含CO₂MMB和CO₂的BF溶液的影响MBs对稻瘟病菌孢子萌发和附着胞形成的抑制作用。菌液处理的孢子萌发率减压型CO₂MB显著低于CO₂MMB、水气循环CO₂MB和稀释1万倍不处理，与水气循环型CO₂MB和稀释5000倍不处理的CO₂MMB相同，但显著低于不处理。1000倍稀释的同时含CO₂MMB的FB溶液可以完全抑制稻瘟霉孢子的萌发，但CO₂MMB溶液不能抑制稻瘟霉孢子的萌发。10000倍稀释的含CO₂MBs的FB溶液对稻曲霉孢子附着胞的形成显著低于CO₂MMB和未处理。用5000倍稀释的同时含CO₂MBs的FB溶液和1000倍稀释的同时CO₂MMB和CO₂MBs的FB溶液均可达到完全抑制效果。

研究了用含CO₂MMB和CO₂MBs的BF溶液处理的稻壳孢子虫的扫描电镜图像。未处理的分生孢子呈松质结构。与此形成对比的是，同时含有CO2MBs的BF溶液处理的分生孢子显示出更深的皱纹;含解压型CO₂MB的BF溶液处理的分生孢子表面损伤明显大于含气-水循环型CO₂MB溶液处理的分生孢子表面损伤。含CO₂MMB的BF溶液处理的分生孢子表面也有皱纹，但程度低于同时含CO₂MMB的BF溶液处理的分生孢子。含CO₂MB的BF溶液处理的分生孢子的宽度小于含CO₂MMB的BF溶液处理的分生孢子，但长度不变。

研究了用含CO₂MMB和CO₂MBs的BF溶液处理的稻纵裂孢子虫透射电镜图像。未处理的分生孢子透射电镜图像、仅用FB溶液处理和含有CO₂MMB的分生孢子透射电镜图像显示，部分分生孢子在膜内、隔膜内均有脂质颗粒排列; 然而，同时含有CO₂MBs的FB溶液处理的分生孢子显示出肿胀或无脂粒，液泡和细胞内空间膨胀。此外，含解压型CO₂MB的BF溶液处理的分生孢子胞内空间位置损伤较气-水循环型CO₂MB更严重。

4. 讨论

高桥认为，MB比表面积大，上升速率慢，导致气体溶解效率高。本研究中，由于两种CO₂MBs处理的BF溶液pH值低于CO₂MMB处理的pH值，所以两种CO₂MBs处理的溶解CO₂浓度均高于CO₂MMB。已有研究表明，热处理后的蜡样芽孢杆菌孢子失活可以通过溶解CO₂和降低pH值来促进，这可以通过添加CO₂来实现。塔卡西还指出，在表面活性剂存在的情况下，MB导致上升速率急剧下降，并在较长时间内抑制和杀菌聚结。此外，表面活性剂的存在降低了MB的尺寸，而MB特征气液界面的物理吸附和物质输运能力增加。因此，我们认为，在有BF存在的情况下，水稻分生孢子稻瘟病菌孢子与CO₂MB的接触增加，是因为在BF存在的情况下，上升速率稳定且下降，导致萌发率下降。

此外，由于气体溶解引起的MB收缩增加了内部压力和表面积，收缩速率呈对数增长。羟基自由基是由于水分子的分解而产生的，在收缩过程中伴随着MB的崩溃，并直接攻击DNA、酶等微生物成分，导致细胞死亡。Takahashi等人也显示了空气MB坍塌产生的羟基自由基对苯酚的分解。Mulakhudair等认为恶臭假单胞菌的失活是由CO₂MB产生的自由基引起的。同样，Kukizaki和Baba指出阴离子表面活性剂溶液中生成的MB的大小小于非离子表面活性剂溶液中生成的MB的大小，并且引起了MB之间的强静电排斥。由于本实验所用的BF溶液中含有阴离子和非离子表面活性剂，因此在MB处理过程中，随着阴离子电荷的增加，羟基自由基的生成可能会增加。结果表明，除溶解CO₂浓度和低pH值外，羟基自由基的生成也对稻瘟病菌的附着

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