应用现代生物技术培育灵芝及其产品开发外文翻译资料

应用现代生物技术培育灵芝及其产品开发

Xuan-Wei Zhou amp; Kai-Qi Su amp; Y ong-Ming Zhang

本研究由中国自然科学基金会、上海市科学技术委员会和上海市

领先学科项目(项目编号B209)资助。

摘要：白腐担子菌灵芝(Ganoderma sp.)在亚洲作为一种药用蘑菇已被长期使用，它具有一系列的药理特性和免疫调节活性，有许多关于其生物活性成分及其药理特性的报道。为了分析灵芝产品的发展现状，本文综述了灵芝的栽培过程及其产品的开发。主要包括灵芝的育种、栽培、生物活性成分的提取、灵芝制品的加工等。本文将扩大人们对灵芝的认识，为灵芝的研究和产业化生产提供有益的参考。

关键词：灵芝； 生物技术； 育种栽培； 开发和利用率

介绍

灵芝是干孢目多孔菌科担子菌的一种，是中国、日本、韩国等亚洲国家最受欢迎的药用菌之一。在过去的30年里，它一直用于现代生物化学和药理学研究中。然而，在中国最早的文献中，这种药用菌并没有被称为“灵芝”，而是被称为“瑞草”或“芝”。汉代以后，灵芝这个名字开始出现在中国古代文献中。值得注意的是，中国古代文献中提到的灵芝与今天真菌分类中描述的灵芝不同。中国古代文献中所记载的，尤其是道教史书，灵芝除了灵芝及其近缘种外，还包括一些属于多孔菌、木耳菌等的真菌。

从现代中医学的角度来看，灵芝在疾病的防治上呈现出三个特点。第一，灵芝的使用无任何毒性，无明显副作用。第二，对某一特定器官无针对性。第三，对器官功能正常化的改善作用。随着生物技术的发展，许多研究者对灵芝的生物活性成分及多种灵芝产品进行了深入的研究。现代药理和临床试验表明，灵芝对各种疾病的防治有显著作用。例如，灵芝的抗癌作用与三萜、多糖和真菌免疫调节蛋白(FIPs)有关，其机制是DNA聚合酶抑制、Ras癌蛋白翻译后修饰抑制或细胞因子产生刺激(Sliva 2006; Ding 等.2009a, b; Ogbe 等. 2011)。近年来，对灵芝次生代谢产物的研究越来越受到人们的关注，人们希望利用灵芝次生代谢产物来开发新药或先导化合物。它在东方和一些非洲国家获得了终极草本物质的声誉。现在灵芝不仅被加入了《中国药典》(Zhou 等. 2007a)，还被加入了《美国草药药典与治疗纲要》(Sanodiya 等. 2009)。因此，从灵芝中分离到多种生物活性成分，包括小分子化合物、多糖、蛋白质、酶、多糖-蛋白质复合物等(Zhong 和 Xiao 2009; Xu 等. 2010a，b; Ferreira 等. 2010; Xu 等. 2011)。由于其独特的药理作用和明显的无副作用，它已经在东方和一些非洲国家获得了终极草药物质的声誉。现在，灵芝不仅被列入《中国药典》(Zhou 等. 2007a) ，而且被列入《美国草药药典和治疗纲要》(Sanodiya 等. 2009)。综述以往的文献，关于灵芝的生物活性成分及其药理学性质的文献较多，并且在这些方面出现了许多评论(Luo 和 Lin 2002; Shiao 2003; Yuen 和 Gohel 2005; Zhou 等. 2007a，b; Sanodiya 等. 2009; Olaku 和 White 2011; Xu 等. 2011)。灵芝之所以受到人们的关注，是因为它是一种潜在的药用大型真菌(Saodiya 等. 2009) ，在民间药物防治疾病方面发挥着重要作用，同时现代药理实验也证实了灵芝的一些作用和性质，包括免疫调节、诱导细胞因子产生、抗过敏、抗辐射、抗肿瘤、抗炎症、抗寄生虫、抗氧化、对心血管系统、呼吸系统、内分泌代谢系统等有益等。(Wasser 2002; Gao 等，2004; Hong 等，2004; Zhou 等，2007a; Mahajna 等，2009)。生物活性成分加工的灵芝产品依赖于上游栽培，如子实体、菌丝体、培养液等，同时灵芝产品也依赖于下游加工。总之，灵芝产品化学成份的定性和定量差异取决于菌株、来源、提取工艺和培养条件(Mizuno 1995; Zhou 和 Lin 1999; Zhou 等. 2008a; McKenna 等. 2002)。在这篇综述文章中，概述了灵芝的栽培方法和条件。随后，将讨论产品加工的现状。最后，对问题和前景进行了分析和展望。这篇综述对研究人员和生产者是有益的。

灵芝属植物的栽培

野生灵芝很难采集和控制其质量。1970 年，一位中国技术人员使用“孢子分离培养法”成功培养灵芝。从那时起，人工培育灵芝已经在中国成为可能。

灵芝的选育。灵芝菌株的优良品质是生产灵芝的前提和关键，不仅影响灵芝产品的产量，而且影响其质量。因此，选择一个好的灵芝菌株是一个非常重要的任务。在任何时候，除了药用真菌外，高产、优质始终是农业重要作物的主要目标。现在有很多育种方法，如大规模选择，程序化突变，杂交育种和转基因育种等。到目前为止，随着现代生物技术的发展，原生质体融合技术广泛应用于蘑菇育种已取得了更大的进展。应用于药用蘑菇育种的转基因工程技术是分子水平上的一项技术创新。然而，选择和转基因育种是更加客观和有希望的，并已经取得了很大的进步，从理论到实践，在过去的20年。图1总结了灵芝的育种策略。

人工选择。人工选择，又称选择育种，是一种原始的育种方法，利用人工手段从自然界中选择优良品系，从生物学上获得新品种，并进行选择性繁殖。人工选择的基本方法是组织分离法和孢子分离法获得纯菌株，然后对该菌株进行优化，最终得到所需菌株(Chen 和 Su 2008)。事实上，在蘑菇生产过程中，由于灵芝孢子难以发芽，常采用组织分离法获得菌株(Lin 和 Zhou 1999a)。比起灵芝，人工选择更常用于其他食用菌的培育。

诱变育种。诱变育种是相对于人工选择的一种新的、更有效的方法，它改变菌株的基因，实现基因重组。诱变育种的一般步骤是:选择原菌株→制备孢子(或原生质体)悬浮液→活菌计数并诱变→培养播散板→拾菌接种→初筛→斜坡培养→重新筛选→优选菌株。通常选择原生质体进行突变育种(Li 等. 2001)，并将生物活性成分增加作为育种目标，如多糖(Gao 等. 2008)、三萜(Li 等. 2001)、有机锗(Dong 等. 2009)等。诱变育种不仅可以通过简单的操作提高品系的突变率，而且可以为进一步的杂交育种和细胞融合育种提供遗传标记。然而，它也有一些缺点。例如突变产生是随机的，选择突变体的工作是复杂的等等。

杂交育种。杂交育种技术是目前应用食用菌或药用菌新种育种中应用最广泛、最有效的育种方法。杂交育种的原则是通过单倍体交配实现遗传重组，然后选择具有亲本优良性状的遗传品系。20 世纪 80 年代以后，杂交育种技术在中国和其他亚洲国家的食用菌育种研究中得到了广泛应用(Zhao 和 Chang 1993; Chiu 等. 2005)。灵芝孢子在人工条件下很难发芽，所以不能获得单核菌株，这是灵芝育种所必需的。因此，灵芝的杂交过程受到限制。因此，在实践中使用原生质体单核发生方法获得新菌株(Wu 等.2009a)。有一些关于人工杂交育种的报道，其中大多数是使用原生质体作为材料选择的(Chiu 等.2005)。

图 1 灵芝属植物的育种策略

细胞融合育种。细胞融合育种是现代生物技术的重要组成部分，也是遗传育种的一次重大飞跃。在细胞原生质体的融合过程中，来自不同生物的不同基因型原生质体在冲破细胞壁后，在融合剂的诱导下相互融合。在这种情况下，融合可以使来自不同属的细胞基因组有效地混合，从而产生一整套基因交换和重组以产生一个新的个体(Tan 等. 2005)。细胞融合工程育种的常用方法是:选择亲本菌株→确保亲本菌株的遗传标记→从亲本菌株中分离原生质体→原生质体再生培养→融合原生质体→再生和培养融合→检测和选择融合。在20世纪 70 年代，这种方法已被广泛应用于担子菌育种(Ferenczy 等.1974)。在 20 世纪 80 年代初，它已经被用于一些亚洲国家的食用菌育种。最初的研究主要集中在灵芝原生质体的分离和制备方面(Choi 等.1987; Li 和 Li，1999; Chen 等.2007a，b) ，然后逐渐应用于通过融合属内原生质体(Park 等，1988)和属间原生质体(Yoo 等.2002)来培养新菌株。一些研究人员还通过原生质体单核发生方法成功地获得了新品种灵芝(Wu 等.2009a)。

基因工程育种。基因工程是分子生物学领域的一项技术创新。利用这项技术，一个物种的DNA序列可以被分离出来，然后转移到另一个物种。同时，供体菌株的优良特性可以在宿主菌株中表达，从而成为高产高质的菌株。这种新的育种方法为食用或药用蘑菇提供了一种新的育种解决方案，特别是对那些受传统育种方法限制的蘑菇。基因工程育种的一般步骤是: 选择供体菌株→分离基因→体外基因重组→将基因导入受体细胞→重组DNA的繁殖和表达→新个体的选择。转化是灵芝基因工程育种的关键。到目前为止，已经有六种转化方法应用于丝状真菌，其中包括原生质体介导的转化(PMT)、农杆菌介导的转化、电穿孔、生物转化、限制性内切酶介导的整合和醋酸锂等(Zhou 等.2010)。这些方法中的大多数已经成功地用于灵芝的育种(Park 等.1991; Sun 等.2001a; Kim 等.2004a)。

例如，Li 等人(2004)构建了真菌表达质粒 pAN7-1(6.7 kb) ，它携带了大肠杆菌hph (潮霉素磷酸脱氢酶)基因和小巢状麴菌gpd (甘油醛-p-脱氢酶)基因的启动子。该质粒能够在真菌培养中表达潮霉素b抗性，并能够用60%聚乙二醇(PEG)4000转化灵芝原生质体。因此它为通过PMT方法转化灵芝原生质体提供了基础(Li 等.2004)。Kim等(2004a，b)报道了基于 REMI技术的灵芝遗传转化和突变体分离的研究。他们构建了携带遗传素(一种氨基糖苷类抗生素)和草铵膦耐药基因的质粒pJS205-1(6.5 kb)。使用限制酶 EcoRV，NotI和XhoI后，将质粒pJS205-1转化为灵芝原生质体。然后获得一系列突变体，并观察其生化特征的初步鉴定(Kim 等，2004a)。例如，Li和Chen (2002)利用含有外源基因的Ti质粒载体将外源基因转化真菌原生质体，使其稳定复制和表达(Li和Chen，2002)。Zhang 等人(2011)在中华灵芝中高效表达水稻 OsUgp2基因，并提高了中华灵芝细胞内外多糖(EPS)的含量(Zhang 等人，2011)。总之，基因工程技术可以为利用二次工程育种灵芝带来新的活力。

建立优质品种的指纹图谱。这对于种植者和研究人员了解优质品种的特征和品质都是至关重要的。选择合适的品种可以决定成败。因此，菌株品质的分析和评价一直是药用蘑菇生产者和研究人员关注的焦点。目前，中国药用蘑菇(包括灵芝)的含量评价主要包括菌丝体或菌株出现、微生物检验、微生物检验、生长速度测定、酯酶同工酶分析、栽培性状等6个主要测定指标。上述栽培性状包括子实体形态、菌丝生长速度、营养阶段(和生殖阶段)、产量等。

现有的品种品质鉴定知识和技术主要是基于栽培试验、鉴定和农艺性状测定种植。在发达国家和发展中国家，蘑菇育种的效果取决于栽培试验的数量。无论如何，从蘑菇遗传学的研究水平来看，DNA特异性分析方法不能直接用于解释和决定菌株质量检测和其他与菌株质量有关的问题(Zhang 等，2005a，b)。目前，灵芝菌株的质量标准已在中国一些能够大规模生产灵芝菌株的省份提出(福建省质量技术监督局 2002 年，安徽省质量技术监督局 2004 年)。采用当地标准对灵芝菌进行鉴定。

不同的观点认为，中药指纹来源于不同的名称，如化学指纹和生物指纹，光谱指纹和色谱指纹等。从现代生物技术分析的角度来看，它包括DNA指纹、蛋白质指纹和化学指纹。目前，关于灵芝化学指纹的研究很多。然而，色谱方法很受欢迎，并在过去十年中得到了深入研究(Xing 等，2004; Huang 等，2004a，b; Zhang 等，2009; Chen 等，2010a，b; Dejaegher 和 Heyden，2010)。随着分子生物学技术的发展，DNA 指纹技术首次被引入真菌，用于研究真菌属、种、菌株等的遗传多样性。随后，介绍了灵芝品种鉴定与鉴定技术(Hseu 等，1996; Shi 等，2008; Wu 等，2009b; Zheng 等，2009)。一些学者试图使用 FIPs 等功能基因来鉴定灵芝(Zhou 等.2008b)。然而，关于如何建立一个有效的指纹，有许多不同的意见(Gottlieb 等，2000; Zhou 等，2005)。总体策略如图 2 所示(Zhou 等.2006)。

DNA指纹图谱主要有两个目的: 鉴定中药的真伪和分析中药的质量。DNA指纹图谱所依赖的DNA分子标记技术可以分为三类: (1)限制性片段长度多态性识别法(RFLP)和其他以电泳技术和分子杂交技术为核心的技术(Tanksley 等，1989; Deragon 和 Landry，1992) ;(2) DNA 指纹图谱和 DNA 测序技术，如随机扩增多态性DNA (RAPD)(bardakci2001)、简单序列重复序列(SSR)、任意引物聚合酶链式反应(AP-PCR)等。(3)扩增片段长度多态性(AFLP)(Vos et al. 1995)、序列特征扩增区(SCAR)、长度多态性直接扩增(DALP)、rflp-PCR、 rapd-PCR以及最新的基因芯片诊断技术。当然，各种各样的分子标记方法有其优点和缺点(Jones 等，1997)。任何种类的标记技术都不能

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