稻瘟病菌菌丝发育、分生孢子和附着胞形成过程中PMK1-MAPK通路的作用和调控的复杂性外文翻译资料

稻瘟病菌菌丝发育、分生孢子和附着胞形成过程中PMK1-MAPK通路的作用和调控的复杂性

Qingchao Jin ^a,b, Chanyuan Li ^a, Youzhi Li ^c, Jinjie Shang ^c, Debao Li ^a, Baoshan Chen ^c，*, Haitao Dong ^a，*

^a浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所，中国 杭州 310058

^b浙江大学宁波理工学院生物与化学工程学院，中国 宁波 315100

^c广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，中国 南宁 530004

摘要：MST50，MST11，MST7，PMK1和GAS1/GAS2基因是真菌PMK1-MAPK信号转导通路中的重要组成部分。稻瘟病菌的这五个基因缺陷的突变体形成稻瘟病的病原体。构建了一个包含4108个独特稻瘟病菌基因的cDNA阵列并用于分析这些突变体针对野生型的基因表达谱，以分析负责分生孢子和附着胞形成的基因表达调控网络。通过这种方法，确定这五种成分的差异调控基因。绝大多数受调控的基因是有突变体特异性的，而所有突变体中只有一小部分是共同基因，这表明这其中的每一个基因都有自己的调控子。调控基因的功能群和表达模式表明：（1）PMK1-MAPK通路中的基因成员与多种信号通路相关；（2）PMK1介导的信号通路的调控是非常复杂的，可能参与其他信号网络；（3）菌丝体发育需要葡萄糖代谢和信号；（4）附着胞形成可能与负责性结合和减数分裂过程有共同的机制，受到碳水化合物代谢的影响。

关键词：稻瘟病菌； 突变体； MAPK信号转导； 转录； cDNA

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路对于真核生物的许多生物过程的调节至关重要，因此被认为是许多人类疾病治疗和预防的潜在药物靶向方式。(Bardwell, 2006; Boldt and Kolch, 2004; Lengeler 等, 2000)。MAPK通路可以由外源因子触发，并且通常通过多步磷酸化激活转录因子而导致信号级联。在真菌中，MAPK介导的信号转导与有性生殖、菌丝生长、渗透胁迫反应、细胞完整性和无性孢子形成有关(Bardwell, 2006)。

稻瘟病菌是稻瘟病的病原菌，其侵染过程与MAPK激激酶(MAPKKK, 由MST11编码)、MAPK激酶（MAPKK, 由MST7编码）和MAPK（由MAPK编码）介导的三条途径有关(Lengeler 等, 2000; Xu, 2000)。在侵染过程中，MPS1起着调节菌丝细胞完整性的作用(Xu 等, 1998)，OSM1负责菌丝细胞的渗透胁迫(Dixon 等, 1999)，PMK1是致病性所必需的(Xu and Hamer, 1996)。PMK1在稻瘟病菌中的构成表达可对该病原菌的生长和致病性产生显著影响(Bruno 等, 2004; Xu and Hamer, 1996; Zhao 等, 2005)。衔接蛋白Mst50已被证明是位于PMK1依赖性MAPK通路（PMK1-MAPK通路）上游的调节因子，在该通路中，其与Mst11和Mst7结合以维持Mst11-Mst7复合物对PMK1编码蛋白的磷酸化的稳定性(Park 等, 2006; Zhao 等, 2005)。PMK1-MAPK通路中，PMK1下游的基因包括转录因子MST12和致病性相关基因GAS1和GAS2 (Park 等, 2002)，这两个基因均在附着胞形态发生过程中表达(Xue 等, 2002)。然而，GAS1 / GAS2的表达受其他未知转录因子而非MST12的控制(Xue 等, 2002)。此外，其他信号相关基因如MGB1、MST20和CHM1也参与稻瘟病菌的PMK1-MAPK通路(Li等, 2004; Nishimura 等, 2003)。迄今为止，通过RNA-Seq和HT-SuperSAGE技术，在Dpmk1突变体的分生孢子萌发过程中仅检测到参与MAPK通路的PMK1对基因调控的影响(Soanes 等, 2012)。对PMK1-MAPK通路进行系统的转录组分析对于全面了解真菌的发育和致病性是必要的。

在本研究中，利用一套包括4108个稻瘟病菌独特基因的cDNA阵列，对稻瘟病菌PMK1-MAPK通路的5个组成部分的无效突变体的基因表达模式进行了监测，并与野生型菌株进行比较。结果表明，这些基因中的每一个基因都调控着属于不同信号通路的不同基因，并在不同的生物过程中发挥不同作用，证明了PMK1-MAPK通路的作用和功能的复杂性。

1. 结果

1.1 MAPK通路无效突变体的鉴定

MAPK通路组分无效突变体的突变体特征总结在表1中。突变体在生长速率上与野生型菌株没有显著差异。然而，突变体△mst50，△mst11和△mst7的分生孢子数非常少，并且相比较而言几乎不产生附着胞。此外，突变体△pmk1在分生水平上与对照组△gas1/gas2差异显著，后者可以产生附着胞。

显微镜分析表明，突变体与野生型的菌丝生长之间没有显著差异，这与先前的报道一致(Park 等, 2006; Xu and Hamer, 1996; Xue 等, 2002; Zhao 等, 2005)。

1.2 cDNA阵列数据的质量评价

利用包含稻瘟病菌菌株Y34的4108个独特基因的cDNA阵列研究突变体△mst50、△mst11、△mst7、△pmk1和△gas1 / gas2中基因表达的变化。仅使用不产生分生孢子的菌丝体进行cDNA阵列分析。野生型70-15、野生型Guy11、△mst50、△mst11、△mst7、△pmk1和△gas1/gas2两个杂交重复结果的系数（r ²）分别为0.94、0.98、0.96、0.95、0.95、0.96和0.98，说明杂交的重复性较高。用qRT-PCR法进一步测定随机抽取的14个基因的14个cDNA阵列杂交点的表达。总的来说，它们与cDNA阵列分析(补充图1)的结果一致，并且大多数基因的相关系数（r ²）大于0.60（表2），证实来自cDNA阵列的数据是可靠的。

1.3 突变体中的基因表达谱

已知突变体△mst50、△mst11、△mst7来自野生型70-15，突变体△pmk1、△gas1 / gas2来自野生型Guy11。研究了70-15和Guy11之间的表达谱，共有621个差异表达的基因(补充表1)。但是这些基因在每个突变体/野生型对中没有表现出差异表达，表明两个野生型菌株之间的表达谱差异在各自的突变体中没有显著反映。因此，在下面的内容中仅对每个突变体中与相应野生型相比的差异表达基因进行了鉴定和讨论。

在4108个排列的基因中，共有938个基因（23％）受到显著的上调或下调(图1)。△mst50中有86个基因，△mst11中有60个基因，△mst7中有151个基因，△pmk1中有264个基因，△gas1 / gas2中有631个缺失GAS1 / GAS2的基因（图2）。在MAPK通路中，MST11、MST7和PMK1按MST50、MST11、MST7、PMK1至GAS1 / GAS2的顺序排列。从这些数据可以明显看出，位于MAPK通路级联下游基因的缺失比级联上游基因的缺失对基因数量的影响更大。此外，这些受调控基因的表达水平在△pmk1和△gas1 / gas2中高于△mst50、△mst11和△mst7（图1）。

在△mst50中，84个（98％）基因表达上调。这些基因被注释为参与许多生物学功能的基因，例如电子传递、氧化磷酸化、蛋白质生物合成、加工和转录调节（图2和补充表2）。

另一方面，突变体△mst11、△mst7和△pmk1中的调控基因主要是下调，分别占相应突变体中总调控基因总数的85％（51个）、95％（143个）、70％（184个）（图2和补充表2）。这些下调的基因与代谢、糖酵解和三羧酸循环、电子传递、氧化磷酸化、细胞信号传导、蛋白质生物合成和加工以及一些转录调控有关。△pmk1突变体的这些数据显示出与Soanes等（2012年）获得的突变体在4小时萌发分生孢子时的数据相似的表达谱。

在△gas1 / gas2中，65％（431个）的受调控基因下调（图2和补充表3）。这些基因参与新陈代谢、糖酵解和三羧酸循环、电子传递、氧化磷酸化、细胞信号传导、蛋白质生物合成和加工以及转录调控。

除了在特定突变体中调控的基因外，还有一些基因在一些或所有突变体中受到调节（图3; 补充表4和5）。例如，在△mst11、△mst7和△pmk1中有30个基因受到调控（图3B; 表3），这表明MST11、MST7和PMK1可能是稻瘟病菌MAPK通路的主干。一些重要的基因如葡萄糖抑制基因（GenBank ID：CK925219）和葡萄糖转运蛋白基因rco-3（GenBank ID：CK919925）在△gas1 / gas2和其他突变体中被发现受到调控（补充表4和5）。

1.4 调控基因的分类

通过K-均值聚类，共有938个调控基因被明确分为8组（图4; 补充表6）。I组含有85个（占分类基因的9％）基因，并在所有5个突变体中均表现出高表达，包括葡萄糖抑制基因（GenBank ID：CK925219）、葡萄糖转运蛋白rco-3（GenBank ID：CK919925）和Rab / GTPase信号转导因子Sec4（GenBank ID：CK919272）。第二组包含110个（占分类基因的12％）基因，第三组包含108个基因（占分类基因的12％），第四组包含96个基因（占分类基因的10％），这些基因在△gas1 / gas2中的表达高于△mst50、△mst11、△mst7和△pmk1，包括G蛋白alpha;亚基基因MAGC（GenBank ID：CK924713）和MAGB（GenBank ID：CK925962）、钙/钙调素依赖性蛋白激酶CMK1（GenBank ID：CK927359）和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶IRE1（GenBank ID：CK919725）。第五组包含63个（占分类基因的7％）基因，这些基因在所有5个突变体中均下调。第六组包含73个（占分类基因的8％）基因，它们在所有5个突变体中的表达均下调，但在△pmk1中的表达最低，包括氨基酸胁迫相关的交叉通路控制蛋白基因CPC1（GenBank ID：CK916504）。第七组包含169个（占分类基因的18％）基因，这些基因在所有5个突变体中均表达下调，但在△gas1 / gas2中表达较低，包括丝裂原活化蛋白激酶基因OSM1（GenBank ID：CK916210）。第八组包含234个（占分类基因的25％）基因，这些基因在△gas1 / gas2中表达较低，但在△mst50、△mst11、△mst7和△pmk1中表达上调，包括钙调素（CaM）（GenBank ID：CK926926）、小GTP酶编码基因Rac1（GenBank ID：CK925749）、cAMP依赖性蛋白激酶编码基因cPKA（GenBank ID：CK917234）以及性结合和减数分裂负调节因子编码基因ran1 （GenBank ID：CK925774）。

1.5 调控基因的功能分类

为了进一步了解所有5个突变体中MAPK通路中单个基因成员缺失后受影响的功能组，共有254个具有功能注释的调控基因，包括来自△mst50的7个基因、来自△mst11的2个基因、来自△mst7的24个基因、来自△pmk1的50个基因和来自△gas1 / gas2的171个基因，根据MIPS程序进行功能分类。(http://mips.gsf.de/proj/funcatDB/search_main_frame.html)。这些基因在功能上可以分为8组（图5; 补充表7）。显然，受影响的功能组的数量随着基因的缺失显示出很大的差异，在突变体△mst50中发现有三个官能团受到很大的影响，包括“电子传递和氧化磷酸化”、“蛋白质的生物合成和加工”和“转录调节（转录因子）”；突变体△mst11中只有两个功能组受到显著影响，包括“糖酵解和三羧酸循环”和“转录调节（转录因子）”；另外三个突变体△mst7、△pmk1和△gas1 / gas2中有三个以上的功能组受到影响；功能组“碳水化合物代谢”在△pmk1中受到最大影响，而“细胞信号”在△gas1 / gas2中受到更大影响；似乎有些受影响的群体是特定的或共同的突变体；例如，“蛋白质生物合成和加工”在△mst11中不受影响，但在△mst50、△mst7、△pmk1和△gas1 / gas2中受到共同影响。

1.6 细胞信号基因的表达

属于MAPK通路成员的几种细胞信号基因在5种突变体中表现出差异表达（表4），包括在△mst11、△mst7和△pmk1突变体中显著下调而在突变体△gas1 / gas2中显著上调的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白alpha;亚基MAGB（GenBank ID：CK925962）；在突变体△gas1 / gas2中均下调的OSM1（GenBank ID：CK916210）和小GTP酶基因Rac1（GenBank ID：CK925749）；以及在△gas1 / gas2中显著上调的CMK1（GenBank ID：CK927359）。其他重要的调控基因包括钙调素（CaM）（GenBank ID：CK926926）和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（Plc1）（GenBank ID：CK9

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