假单胞菌环脂肽对稻瘟病菌的诱导抗性和拮抗作用外文翻译资料

假单胞菌环脂肽对稻瘟病菌的诱导抗性和拮抗作用

Olumide Owolabi Omoboye¹, Feyisara Eyiwumi Oni¹, Humaira Batool¹, Henok Zimene Yimer¹, Reneacute; De Mot² and Monica Houml;fte^1*

（¹植物病理实验室，植物和农作物系，生物科学工程，根特大学，比利时 根特；²微生物和植物遗传学中心，生物科学工程，比利时 赫弗利 库鲁汶）

摘要：假单胞菌产生一系列的抗菌次级代谢产物，如环脂肽(CLPs)。我们研究了产CLP的假单胞菌及其粗提取物对水稻稻瘟病菌的直接拮抗抑制和诱导抗性(ISR)。植物生物防治试验结果表明，产lokisin、WLIP、entolysin和产N3的菌株均能成功诱导对稻瘟病菌VT5M1的抗性。此外，lokisin、WLIP和entolysin的粗提取物在植物体内的ISR检测结果相似。相反，产生xantholysin的菌株和N3、xantholysin和orfamide的粗提取物对稻瘟病没有诱导抗性。利用WLIP缺失突变体进一步证实了WLIP在触发ISR中的作用。接种前用N3、lokisin、WLIP、entolysin或orfamide粗提物预处理稻瘟病菌孢子，稻瘟病的严重程度显著降低。体外显微分析进一步揭示了粗制的N3、lokisin、WLIP、entolysin、xantholysin和orfamide对稻瘟病菌附着孢形成有显著抑制作用。此外，还描述了生产菌株中lokisin和WLIP的生物合成基因簇。总之，我们的研究证明了结构多样的CLP在水稻稻瘟病防治中的生物活性。此外，我们提供了深入了解非核糖体肽合成酶基因编码的WLIP和lokisin生物合成机制。

关键词：lokisin；anikasin；WLIP；entolysin；xantholysin；CLP N3；非核糖体肽合成酶；ISR

概述

在根际和土壤微生物中占主要的是荧光假单胞菌属，其属于变形杆菌门（Philippot et al., 2013）。根际相关假单胞菌的生物防治能力已被广泛研究（Haas and Deacute;fago, 2005; Weller, 2007; Drsquo;aes et al., 2010; Houml;fte and Altier, 2010; Olorunleke et al., 2015b; Stringlis et al., 2018）。假单胞菌属在代谢上具有多样性，能产生一系列次级代谢产物，包括各种抗生素和环脂肽（CLPs） （Gross and Loper, 2009）。CLP是两亲性分子，由与脂肪酸尾相连的环状寡肽内酯环构成（Raaijmakers et al., 2006, 2010）。CLP是由非核糖体肽合成酶（NRPSs）合成的，其中包含不同的包含缩合、腺苷酸化和硫化域的模块，用于特定（脂）肽的共线性合成，并通过硫酯酶活性以线性或环状形式释放（Finking and Marahiel, 2004; Strieker et al., 2010）。根据寡肽的长度，假单胞菌CLP目前至少分为14个不同的组（Gross and Loper, 2009; Olorunleke et al., 2015b; Geudens and Martins, 2018）。这些基团中的脂质部分通常是羟基癸酸。在体外和体内条件下，假单胞菌CLP对几种植物病原菌具有生物防治潜力，包括群结腐霉（Oni et al., 2019a,b），瓜果腐霉（Michelsen et al., 2015），致病疫霉、辣椒疫霉和终极腐霉（Van Der Voort et al., 2015），立枯丝核菌（Drsquo;aes et al., 2014; Michelsen et al., 2015; Olorunleke et al., 2015a），宫部旋孢腔菌和稻瘟病菌（Ma et al., 2017）。

水稻（Oryza sativa L.）是世界50%以上人口的主要主食，是全球重要的粮食作物（Fageria and Baligar, 2003）。然而，这种作物同时受到非生物和生物胁迫的影响（Mittler, 2006; Pandey et al., 2015）。在水稻常见的生物胁迫中，由丝状子囊菌稻瘟病菌引起的稻瘟病，因其发生的普遍性和危害性而被列为水稻最重要的病害之一（Dean et al., 2005）。这种真菌是一种半生物营养菌，其感染过程需要初始的生物营养阶段，在此阶段，病原体在健康的植物细胞内形成球状的侵入性菌丝（Koga, 1994）。随后转为坏死性生长，导致植物细胞死亡。稻瘟病菌利用附着体通过产生膨压渗透水稻的表皮（Wilson and Talbot, 2009; Yan and Talbot, 2016）。

由良性假单胞菌属菌株引起对稻瘟病菌生物防治的报道很少（Spence et al., 2014; Hernaacute;ndez-Rodriacute;guez et al., 2018; Wu et al., 2018）。据报道，良性假单胞菌属物种产生的Orfamide可诱导水稻对褐斑病菌宫部旋孢腔菌的系统抗性，但不诱导对稻瘟病菌VT5M1的系统抗性（Ma et al., 2017）。更重要的是，产生orfamide的菌株假单胞菌CHA0不会诱导对水稻稻瘟病菌的抗性（Spence et al., 2014）。另一项研究表明，orfamide对抑制稻瘟病菌有直接作用并且减少水稻稻瘟病的严重性（Ma et al., 2016a）。莫氏假单胞菌BS011对稻瘟病菌有较强的抑制活性，而这种活性需要一个最有可能介导xantholysin产生的基因簇。此外，莫氏假单胞菌BS011的一种粗体物抑制了稻瘟病菌生长并破坏了附着胞的形成（Wu et al., 2018）。

材料和方法

菌株、培养基和生长条件

本研究中使用的假单胞菌和稻瘟病菌菌株如表1所示。对野生型假单胞菌进行了分离培养，28℃琼脂培养48小时。在添加了50mu;g/ml卡那霉素的KB（King et al., 1954）琼脂上，在28℃下培养假单胞细菌的WLIP缺失性突变株RW10S2。假单胞菌菌株的肉汤培养是在KB肉汤中以150rpm/min的速度在摇床上获得的，并在28℃下培养约24小时。稻瘟病菌分离物VT5M1（Thuan et al., 2006）在28℃完全培养基（CM）上（Talbot et al., 1993）培养5-8天。

粗CLP的提取

从假单胞菌菌株中提取粗CLP是按既定的方案进行的（Oni et al., 2019a）。将假单胞菌菌株在KB琼脂上过夜培养，然后在5ml KB培养液的无菌玻璃管中以150r/min、28°C培养24小时，获得种子培养物。培养24h后，将其转入含400ml KB肉汤的2L锥形瓶中，以150r/min、28℃培养24h。在10000g和4℃下离心培养10min，然后用6N盐酸持续搅拌酸化至pH2，获得无细胞上清液。将酸化培养上清液置于4℃下过夜，以沉淀CLP。沉淀的CLP经过10000g离心10min后，用100%甲醇提取粗CLP。在室温下蒸发溶剂以获得粗CLP样品。粗orfamide A是根据不同的程序从假单胞菌CHA0中提取的（Ma et al., 2016a）。

稻瘟病菌分离菌株VT5M1和粗CLP的体外生物测定

本研究中使用的不同粗CLP可溶解100％二甲基亚砜（DMSO）原料。用0.1％DMSO进行进一步稀释以获得所需的生物测定浓度。五天龄的稻瘟病菌分离株VT5M1的孢子（5times;10⁴孢子/ mL）从CM琼脂平板上收集，并与不同的CLP粗提物和0.1％DMSO混合后混合。在此实验中，将100micro;L的不同浓度：1，5，10和25micro;g / mL的每种粗CLP与100micro;L的稻瘟病菌混合，阴性对照则加入100micro;L 0.1％DMSO。将50mu;L的混合物转移到塑料载玻片（Fisher Scientific，比利时）上，并在28℃下培养。在4h的一个培养阶段后，通过计数发芽管数来评估孢子萌发。培养8h后，通过随机计数至少50个孢子来鉴定附着体的形成。使用奥林巴斯BX51显微镜进行显微镜观察。实验进行两次。

Xantholysin生产菌株对稻瘟病菌的体外拮抗作用

用培养皿法研究了xantholysin产生菌株COR51和BW11M1对稻瘟病菌VT5M1和Guy11的体外拮抗作用，如Desai等人（Desai et al., 2002）和Wu等人（Wu et al., 2018）所描述的。具体地说，在距中心2cm的CM板两侧都发现了3micro;l过夜的Luria Bertani（LB）肉汤培养测试菌。将平板放置在25°C下培养24h，然后将VT5M1或Guy11（直径5 mm）的菌丝体栓塞置于平板中心。将平板置于25℃下再培养6-10天。

假单胞菌属的系统发育分析

本研究中使用的产lokisin，WLIP和xantholysin的假单胞菌菌株的基因组序列是从菌株的基因组序列草稿中提取的。从GenBank中检索选定的假单胞菌型菌株的序列（补充表S1）。序列使用MEGA6中的MUSCLE（Edgar, 2004）进行排列（Tamura et al.,2013）。系统树通过最大似然法与1000个引导程序复制和铜绿假单胞菌构建，分别产生外附rpoB 和rpoD，然后通过组合两个基因的比对序列获得级联树。

统计数据分析

数据分析采用SPSS 25统计软件。为了比较不同的处理方法，使用了单变量方差分析和图基检验，结果被认为有统计学差异（plt;0.05）。

结果

产CLP假单胞菌菌株诱导水稻对稻瘟病系统抗性的潜力

通过土壤接种试验，研究了产CLP假单胞菌对水稻抗稻瘟病的诱导能力。结果表明，N3-、WLIP-、lokisin-和entolysin产生菌株COW3、COW10、COR10和COR5均能成功诱导水稻对稻瘟病菌的抗性。这些产生CLP的菌株对COW3、COW10、COR10和COR5的保护率分别为52%、54%、58%和48%，阳性对照（BTH）的疾病严重度降低了86%。然而，产生xantholysin的菌株COR51只降低了10%的疾病严重度，不能显著地保护水稻植株抗稻瘟病菌（图1 A、B）。此外，在10⁸~10⁹ CFU/g鲜根范围内，通过测试假单胞菌菌株成功定植水稻根（表2）。

CLP粗提物诱导水稻对稻瘟病系统抗性的潜力

以25mu;g/mL的N3、WLIP、lokisin、entolysin和xantholysin粗提物为材料，通过土壤淋湿生物测定，测定了它们对水稻植株VT5M1的诱导抗性。用25mu;g/mL BTH浸湿的土壤作为阳性对照。由于以往的研究表明，该CLP不能诱导稻瘟病的抗性，故将orfamide作为阴性对照（Ma et al., 2017）。Lokisin、WLIP、entolysin在水稻植株上表现出抗稻瘟病菌的ISR。Lokisin的保护率为78%，其次是WLIP（61%）和entolysin（50%）。相比之下，xantholysin和orfamide都降低了14%的病害严重度，而N3则降低了17%的病害严重度。这些值与病害对照组没有显著差异（图2 A、B）。

WLIP在ISR中水稻抗稻瘟病诱导的作用

为了进一步解释WLIP在ISR中的作用，我们使用了WLIP产生的假单胞菌菌株COW10、NSE1和RW10S2，以及水稻稻瘟病菌生物鉴定中先前在RW10S2前提下产生的WLIP缺陷突变体（恶臭假单胞菌CMPG2120，CMPG2169和CMPG2170）（表1）。结果表明，产生WLIP基因的RW10S2诱导了对稻瘟病菌的抗性，与其他WLIP基因（COW10和NSE1）类似，但与BTH基因对照相比，RW10S2具有中等水平的保护作用。然而，WLIP缺陷突变体CMPG2120，CMPG2169和CMPG2170失去了对稻瘟病菌抗性的能力（图3 A、B）。所有供试菌株的生根定植能力均达到10⁸CFU/g鲜根（表3）。

粗CLP与稻瘟病菌孢子共用对降低稻瘟病严重程度的潜力

在将真菌接种于水稻叶片之前，先将CLP粗提物与稻瘟病菌孢子混合。N3，WLIP，lokisin，entolysin和orfamide提取物可降低水稻稻瘟病的严重程度（图4 A、B）。爆发严重性的相对降低范围从entolysin和orfamide的29%到lokisin的69%，后者提供了与BTH

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