验证斑马鱼（Danio rerio）参照基因的标准化实时荧光定量PCR外文翻译资料

验证斑马鱼（Danio rerio）参照基因的标准化实时荧光定量PCR

Rongying TANG, Andrew DODD, Daniel LAI, Warren C. MCNABB, and Donald R. LOVE

School of Biological Sciences, University of Auckland, Private Bag 92019, Auckland 1142, New Zealand; Food and Health Group, AgResearch Grasslands, Private Bag 11008, Tennant Drive, Palmerston North, New Zealand

摘要：实时荧光定量PCR的标准化对于精确获得基因表达数据很重要。最常见的反转录定量PCR的标准化是使用参照物，或者管家基因。然而，有越来越多的证据显示甚至是管家基因也会在不同情况下其表达量也会被调控。反转录定量PCR最近被用于基因表达研究的方面，并且没有被证实有成套的参照基因。我们的研究旨在于9个可能的斑马鱼发育进程中和特定组成的参照基因。所有9个参照基因展现了不同的表达情况。beta;-actin，EF1alpha;和Rpli3alpha;基因组成了一个被证实的参照基因组用来研究斑马鱼发育时间进程EF1alpha;, Rpl13alpha; and 18S rRNA基因更适合作为斑马鱼组织分析研究。重要的是，斑马鱼GAPDH基因在上述两种情况下都显得不适合作为参照基因。

关键词：斑马鱼；定量实时荧光反转录PCR；管家基因；GAPDH基因；GeNorm(内参分析软件)

荧光标记技术的应用和新器材导致了实时荧光定量反转录PCR方法的发展，这使得转录组水平的实时定量检测成为可能[1]。不同于传统的PCR只能检测最后的反应表达量，实时荧光定量反转录PCR可以边扩增边检测表达量。它提供一个快速自动化的多转录本水平的检测，兼具高敏感，高产量，和一个相当大的灵活范围。

一个常见的标准化实时荧光定量反转录PCR数据方法是同时扩增内源基因，或者一个管家基因[1,2]。理想化的情况下，这种参照基因应该在所有样本表达一致，例如，不同组织，在所有发育时期，实验操作前后[1]。然而，越来越多的证据表明常见的管家基因能够明显地在不同条件下改变表达量。例如，beta;-actin 转录本的表达量会根据实验处理方式的不同表达量有明显差异，GAPDH基因的表达在发育中也有所不同[1,3]。因此，这就证明了参照基因应当使用一套标准化的，参照基因在实验条件下也应当被证实有效性。

实时荧光定量反转录PCR最近被用于基因表达研究。用PubMed检索“real time PCR”和“zebrafish”显示有64篇关于斑马鱼基因表达分析的文献在2001-2006年出版。其中涉及参照基因的，beta;-actin和GAPDH基因是最常见的。之前用到beta;-actin 和GAPDH的研究应该被警告其基因表达数据的准确性值得怀疑。迄今，还没有被证实有成套的用于斑马鱼研究的合适实时荧光定量反转录PCR的参照基因。

这个研究的目的在于评估一套用于标准化参照基因，它用于斑马鱼实时荧光定量反转录PCR的数据。候选的参照基因在胚胎发育和成鱼组织样本中被测试表达稳定性。

材料和方法

斑马鱼

野生型斑马鱼从商业化提供者手中购买（好莱坞鱼场，奥克兰，新西兰），鱼在一个专用的设备中饲养。斑马鱼设备被维持在一天14小时的有光环境，温度为26-27摄氏度。成鱼被喂养在27.5升的有循环水的架子系统的鱼缸中。雌雄比为2:1.成鱼。成鱼饲料为干鱼饲料或者丰年虾。成年雄雌鱼被分开一周以便于交配。收胚胎需要4雄3雌。

RNA萃取

10个发育阶段用来选择斑马鱼的发育时期研究：球状期（4hpf），胚环（5.7hpf），75%外包（8hpf），芽（尾，头）（10hpf），3体节（11hpf），6体节（12hpf），10体节（14hpf），18体节（18hpf），prim-16（31hpf），突嘴（72hpf）。斑马鱼胚胎来源于单个受精卵，20个斑马鱼胚胎放在一起可以用于特定发育时间点的RNA提取。斑马鱼的组织成分组来自于萃取成鱼眼，心脏，肝，肠，肌肉，皮肤，卵巢的RNA。时间进程和组织组成研究重复进行研究。斑马鱼胚胎或解剖的斑马鱼组织在液氮中快速冷冻，之后通过彻底的1mL Trizol试剂，同时使用最大转速的匀浆器搅拌匀浆。250uL氯仿，加入后涡旋15秒，室温保存3分钟，之后12000g离心5分钟，上清液包含RNA，小心转移到新管中同时不能触碰到上下相的分界面。之后加70%的乙醇沉淀RNA，之后加载到旋转离心柱中纯化。

RNA浓度和质量分析

RNA浓度用NanoDrop ND-1000光谱仪来测浓度；每个RNA样本测试3次取平均值。RNA样本质量用Agilent 2100生化分析仪检测，遵照仪器说明书操作。0对应完全降解RNA和10对应于完整的RNA。对于所有的实时荧光定量反转录PCR而言，只有RNA样本为RIN为至少7.5的才会被使用，大量的主体样本而言RIN值要至少为8.0。这些值保证的实时荧光定量反转录PCR实验的可靠性。

第一链cDNA合成

共计1ugRNA被反转录以产生cDNA用于Superscript III反转录，根据之前的描述基本用随机六聚体引物。在所有情况下，一个反转录的阴性参照用于测试基因组DNA的污染。

引物设计

首先，13个文献中的待选参照基因被选择用于实时荧光定量反转录PCR。为了最小化基因共调控的影响，参照基因的选择尽可能来自于许多不同的生物学途径。对于18S rRNA，一个通用的Taqman探针（由Applied Biosystems提供）被使用。对于剩下的12个基因，斑马鱼在哺乳动物中的同源基因转录组成取自NCBI数据库和Ensembl数据库。斑马鱼基因的每一个外显子通过斑马鱼基因组DNA序列数据库BLAST检索来确定，同时使用哺乳动物序列数据库。人和斑马鱼管家基因氨基酸的比对用以确定每个外显子的阅读框，剪切位点用来手动注释。为了优化跨越外显子边界的引物设计，引物设计软件用到NetPrimer。它能够通过扫描用于二级结构的组成以及预测退火温度引物序列分析引物质量。除了beta;-actin和HPRT基因，所有引物对有至少一个引物跨过一个外显子-外显子边界。引物被设计拥有相似的解链温度和给出相似的复制子大小。扩增产物可在1%的琼脂糖凝胶进行电泳，对所有基因除了TBP, tubulin and YWHAZ的复制子来说一个小片段被保留了；这三个基因被排除在分析之外，这个显然独一无二的复制子显示了一个在Biosystems 7900HT real-time PCR platform仪器上熔解曲线上的峰。之后的实验表明PBGD的引物都有很低的PCR效率，因此这种基因被排除在分析之外。

实时荧光定量反转录PCR

对于所有的参照基因，除了18S r RNA，实时荧光定量反转录PCR都可以用SYBR green来操作。标准的反应（10uL）体系在Eppendorf epMotion机器人中自动化组装，体系成分如下：5 mu;l of Platinum SYBRgreen qPCR supermix-UDG with Rox (Invitrogen), 0.2 ul of forward primer (10 mu;M), 0.2 mu;l of reverse primer (10mu;M), 2 mu;l of template and 2.6 mu;l DEPC water. 模板被溶解在1:10的cDNA样本中，在阴性对照的情况下，cDNA被DEPC水替代。所有的定量实验都在三重复的条件下进行，仪器使用Applied Biosystems 7900 HT real-time PCR platform。40个扩增循环之后，每个循环由94摄氏度15秒之后59度1分钟。扩增和熔解曲线通过SDS 2.2软件来进行基因表达分析。

数据分析

Ct值通过每个参照基因来获得。在去除离群值之后，原始数据被到处都软件LinReg中来确定PCR扩增效率。所有的扩增都有PCR相似的大约1.9的效率值；PCR效率值接近2表明是有效的扩增。

每一对引物的PCR扩增效率，以及Ct值，都被用于计算每一个转录本的基因表达量，根据公式E Delta;Ct (Min Ct-Ct sample)，这里E代表PCR效率值，Min Ct代表相关引物对的最低Ct值，Ct sample代表每一个扩增的Ct值，一个标准误被用来计算数据的误差

相关9个基因的稳定程度的计算要使用到GeNorm。这个软件计算每个参照基因的基因表达稳定程度值（M），并且这些基因按照稳定程度大小排列。

结果

斑马鱼胚胎发育时期的参照基因表达量

基于转录本丰度，9个在不同胚胎发育时期的参照基因的原始表达水平的评价表明这些基因可以归为3类：（1）.高转录本丰度（平均Ct值低于20）：beta;-actin, EF1alpha;, Rpl13alpha; 和

18S rRNA 基因；（2）.中等转录本丰度（平均Ct值在20-25之间）：HPRT, RNAP 和 SDHA；

（3）低转录本丰度（平均Ct值在25-30之间）：beta;2mic 和 GAPDH

在发育进程研究中9个参照基因的相对表达水平被输入GeNorm中来计算表达稳定程度M值。

GeNorm 依赖两个理想的管家基因表达比值应当在所有样本，无论细胞类型或者条件这种原则。因此，任何两种管家基因相对表达量比值的波动都会表明一个或者两个基因都没有稳定表达；增多的突变和减少的基因稳定性成正相关。M值代表一个受测基因和其他受测基因以及低M值的一个取平均的成对变异值，这对应于稳定的基因表达。

标准化的基因表达数据表明发育早期RNAP基因表达很高，在球状期到达顶峰（4hpf）。这种结果符合发生在相应发育时期的基因表达过程。在斑马鱼胚胎发育中，囊胚转换（MBT）发生在细胞循环10（大约2-3hpf），这标志着合子基因转录的起始。Kane和Kimmel的工作表明RNA合成活动的爆发发生于MBT，这一时期有效地增加了数个循环。这一发现可能解释了球状期（细胞循环13）没有标准化的数据，然而，没有证实在斑马鱼胚胎发育阶段高水平的RNAP基因表达。

用GeNorm评价GAPDH基因，可得出其为最低表达稳定性的基因，这在没有标准化和标准化数据中很明显。几乎所有不明显的GAPDH基因表达发生于早期胚胎发育阶段包括囊胚期，原肠胚期以及体节期。但一个表达量的增长发生于咽胚期，这一增长在孵化过程中相当剧烈。这些数据与Rauch等人的研究一致，他们进行了斑马鱼早期胚胎的原位杂交，得到的结果为GAPDH基因直到Prim 5阶段还不能检测到。在发育早期一个单独的研究表明也不可检测到GAPDH的基因表达。综上所述，这里有明显有力的证据表明GAPDH基因在斑马鱼胚胎发生阶段中被差异化调控。

讨论

这一研究在这里描述了beta;-actin, EF1alpha;和 Rpl13alpha;基因提供了一套被证实用于斑马鱼发育时间进程的参照基因，但EF1alpha;, Rpl13alpha; and 18S rRNA 基因更适合组织分析。重要的是，GAPDH基因表现出不适合作为两种情况下的参照基因选择。

EF1alpha;和 Rpl13alpha;对于两种证实的基因的组成很常见。两种基因表达产物都参与了翻译，因此他们是这些参照基因组成中最稳定的基因并不令人感动惊奇。这一发现和三个描述大马哈鱼参照基因表达的文献的结果很相似。Jorgensen等人的研究表明精确的标准化转录本数据可以通过18S rRNA, EF1alpha; 和 RPL1基因的组合获得。Olsvik等人证实EF1AA和EF1AB基因适合相同鱼种转录本的表达基因的研究。Ingerslev等人证实EF1alpha;基因适合作为三种以及被评价的参照基因。

之前，18S rRNA基因被认为是一个实时荧光定量反转录PCR理想的参照基因控制，作为rRNA表达水平表现出相对更少的mRNA表达。这个结果逐渐被这种研究支持。在发育时期进程和组织研究中18S rRNA在所有参照基因的原始表达数据表现出最少的变异性。然而，在用GeNorm研究之后，18S rRNA基因排在EF1alpha; 和 Rpl13alpha;之后；一个相似的发现在大西洋大马哈鱼被报告。使用18S rRNA作为参照基因的其中主要的一个限制rRNA 和 mRNA片段的不平衡可能发生在样本中，这使得18S rRNA相比之下不适合作为计算mRNA相对水平的参照基因。因此必须警告那些使用18S rRNA作为参照基因的行为。相比之下，mRNA编码参照基因更适合用于数据的标准化。作为一个额外的警告，当EF1alpha;被证实作为斑马鱼时间进程分析的参照基因，面对压迫环境下的人细胞的上升调控中这种参照基因在研究中的使用可能会引起应激发应。

迄今为止，beta;-actin一直是最常见的用以标准化斑马鱼实时荧光定量反转录PCR

的参照基因，时间进程分析已经表明beta; –actin基因是三种基因中最适合的基因，它和它的细胞活动性的角色相协调，这贯穿于整个胚胎发生过程中。相比之下，这种基因的表达不太适合组织分析方面。之前描述组织特异性beta;-actin基因表达的文献表明它在死后大脑标本中的表达呈现出差异性，并且人类心脏组织的评价提供了证据否定了这种基因作为参照基因。这

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 7 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[286328]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word